连翘叶黄酮类化合物通过调控细胞周期抑制腺病毒感染的作用机制：基于UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap/MS与实验验证的多组学研究

本研究通过UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap/MS技术鉴定连翘叶（FSL）中39种活性成分（以黄酮类为主），结合网络药理学与分子动力学模拟发现其通过靶向细胞周期核心蛋白（CCNB2/CHEK1/CDC25A等）诱导G2/M期阻滞，显著抑制人腺病毒（HAdV）复制。实验验证表明FSL可剂量依赖性下调病毒早期基因（E1A-E4）表达，为开发抗HAdV植物药提供新策略。

　　

引言

人腺病毒（HAdV）作为无包膜双链DNA病毒，可引发呼吸道感染、结膜炎和肝炎等疾病，在未接种疫苗人群中导致超过50%的肺炎病例。当前临床治疗依赖肾毒性药物西多福韦，但其对重症肺炎有效率不足40%。传统中药连翘叶（Forsythia suspensa leaves, FSL）作为连花清瘟颗粒的主要成分，已被证实具有广谱抗病毒活性，但其抗HAdV的分子机制尚未阐明。本研究首次通过多组学整合策略，揭示FSL黄酮类成分通过调控宿主细胞周期抑制HAdV复制的创新机制。

方法

研究采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱（UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap/MS）鉴定FSL活性成分，从GEO数据库获取HAdV感染相关差异表达基因（DEGs）。通过网络药理学构建"药物-成分-靶点-通路"网络，采用Autodock Vina进行分子对接，Gromacs 2022.3完成100 ns分子动力学（MD）模拟。体外实验通过流式细胞术检测细胞周期分布，RT-qPCR和Western blot分析病毒基因及蛋白表达。

结果

1. 1.

   成分鉴定：从FSL中鉴定出39种活性成分，包括黄酮类（山柰酚、木犀草素等）、有机酸、萜类和木脂素，其中4种黄酮化合物与核心靶点结合能达-6.7至-9.2 kcal/mol。

2. 2.

   关键靶点：筛选出30个FSL-HAdV共同靶点，PPI网络显示CCNA2、CHEK1和AURKA为枢纽蛋白（degree≥14）。KEGG富集分析揭示这些靶点显著富集于细胞周期通路。

3. 3.

   分子机制：MD模拟证实黄酮-蛋白复合物稳定性（RMSD<0.25 nm），其中木犀草素-CHEK1复合物通过1-3个氢键维持结合，自由能景观显示Rg值稳定在1.92-2.03 nm。

4. 4.

   功能验证：FSL处理使A549细胞G2/M期比例从47.8%增至76%，同时剂量依赖性抑制HAdV E1A蛋白表达（750 μg/mL时降低82%）。关键调控因子CDC25A表达下调，而CCNB2、AURKA等基因表达上调2-4倍。

讨论

本研究首次阐明FSL黄酮通过"多成分-多靶点"协同作用干扰HAdV复制周期：

1. 1.

   直接作用：黄酮类成分通过π-π堆积和氢键与细胞周期蛋白结合，其中山柰酚-CCNB2复合物形成4个稳定氢键。

2. 2.

   细胞周期干预：通过抑制CDC25A磷酸酶活性，激活CHEK1介导的检查点信号，导致CDK1/2失活和G2/M期阻滞，从而阻断病毒DNA合成所需的S期环境。

3. 3.

   临床意义：FSL诱导的G2/M期阻滞不同于传统抗HAdV药物作用机制，为免疫缺陷患者提供潜在替代疗法。

结论

该研究通过"化学表征-网络预测-实验验证"研究范式，系统解析FSL抗HAdV的细胞周期调控机制，为开发靶向宿主因子的广谱抗病毒中药提供理论依据。未来需通过X射线晶体学验证复合物结构，并开展体内实验评估治疗效果。