基于基因编码生物传感器Glusor的戊二酸代谢与转运机制研究及其在疾病诊断与生物制造中的应用

这篇研究开发了一种基于转录调节因子CsiR和环状置换黄色荧光蛋白（cpSFYFP）的基因编码荧光生物传感器Glusor，实现了对戊二酸（glutarate）的高灵敏度、实时动态检测。该传感器可精准量化人体体液和细菌发酵液中的戊二酸浓度，支持戊二酸尿症（glutaric aciduria）的便捷诊断和微生物生产监测。研究进一步利用Glusor揭示了大肠杆菌（E. coli）中KgtP和YnfM转运蛋白的摄取/外排功能，并阐明了戊二酸羟化酶（CsiD）和戊二酰辅酶A脱氢酶（GcdH）在细胞代谢中的作用，为代谢疾病机制和生物合成研究提供了新工具。

引言

戊二酸作为平台化学品广泛应用于聚酯和聚酰胺生产，同时也是参与T细胞调控等生理过程的内源性代谢物。其代谢异常会导致遗传性代谢疾病戊二酸尿症（GAI），但现有检测方法如高效液相色谱（HPLC）和质谱（LC-MS/MS）存在耗时、成本高的问题。本研究通过改造转录调节因子CsiR，开发了新型荧光生物传感器Glusor，实现了对戊二酸的高效检测与代谢研究。

CsiR作为戊二酸识别元件的鉴定

通过荧光热漂移（FTS）实验证实CsiR特异性结合戊二酸，其配体结合域（LBD）的Y84、R87和R168残基是关键作用位点。分子动力学模拟显示，戊二酸结合诱导CsiR构象变化（RMSD达2.25 ?），为传感器设计奠定基础。

Glusor的设计与优化

通过四步策略构建传感器：1）在CsiR的α-10螺旋插入cpSFYFP，获得初始变体Glusor-1（ΔR_max=43%，K_d=1.28 μM）；2）在LBD环区插入荧光蛋白，优化出Glusor-2（ΔR_max=153%）；3）截除DNA结合域（DBD）获得Glusor-3（ΔR_max=267%）；4）通过饱和突变优化连接肽，最终获得Glusor（ΔR_max=646%，K_d=60.68 μM）。该传感器对戊二酸类似物（如^l-2-羟基戊二酸）无交叉反应，且响应速度达秒级。

Glusor在生物样本检测中的应用

传感器在细菌培养基（MSM）、血清和尿液中检测限低至0.21–1.62 μM，与HPLC结果高度一致（R²>0.99）。以^{恶臭假单胞菌}（P. putida）为例，Glusor成功监测到ΔcsiDΔgcdH双敲除菌株的戊二酸积累（105.3 g L^?1）。代谢流分析进一步揭示，93.38%的戊二酸通过羟化途径（CsiD介导）降解。

活菌中戊二酸转运机制解析

利用Glusor首次发现^大肠杆菌中KgtP作为质子耦合转运蛋白（K_m=23.34 μM），可摄取戊二酸和2-酮戊二酸（2-KG）；而YnfM介导戊二酸外排。碳饥饿实验显示，抑制羟化酶CsiD会导致胞内戊二酸积累，证实其在代谢中的核心作用。

HEK293FT细胞中戊二酸代谢可视化

亚定位实验显示，戊二酸在线粒体和核内浓度较高，与GcdH的分布一致。过表达转运蛋白SLC22A6（OAT1）可增强细胞对戊二酸的摄取。缺氧或GcdH抑制剂MYCi975处理均导致戊二酸积累，印证了HIF-1α-GcdH通路在代谢调控中的作用。

讨论与展望

Glusor为戊二酸尿症诊断提供了低成本解决方案（较质谱节省90%时间），并助力微生物制造工艺优化。未来可整合至穿戴设备实现实时监测，或用于筛选靶向转运蛋白（如OAT4）的 therapeutic drugs。该研究为代谢物检测与调控研究提供了范式。

（注：全文严格依据原文数据，未添加非文献支持内容；专业术语如RMSD、K_d等均保留原文格式；省略了文献引用标识和图表标注）