基于流式细胞术的等离子体来源细胞外囊泡亚群分选技术优化及其在肿瘤生物标志物研究中的应用

本研究针对血浆来源细胞外囊泡(EVs)分选技术存在的纯度低、背景干扰大等关键问题，开发了基于蔗糖垫超速离心结合流式细胞术的CD9+ EVs分选方案。通过优化荧光触发阈值(300)、采用70μm喷嘴和尺寸排阻色谱(SEC)去除非结合试剂，实现了15K events/s的高通量分选，NTA和TEM证实分选后EVs保持完整形态(164.8±9.7nm)，Western blot显示Alix、Flotillin-1等标志物表达保留。该技术成功应用于血小板来源CD42a+ EVs分选及miRNA分析，为肿瘤微环境研究提供了新工具。

　　

在生命科学领域，细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)犹如微观世界里的"分子快递员"，携带蛋白质、核酸等生物活性物质穿梭于细胞间。这些直径仅100-1000纳米的膜泡在肿瘤转移、免疫调控等过程中扮演关键角色，尤其血浆中的肿瘤相关EVs更是潜在的"液体活检"宝藏。然而，要从复杂的血浆"分子海洋"中精准捕获特定EV亚群，却面临着三大技术瓶颈：传统分离方法纯度不足、流式检测时纳米级颗粒易产生"蜂群效应"(swarming effect)、以及染料/抗体非特异性结合导致的背景干扰。

为破解这些难题，Daniele Reverberi团队在《Biological Procedures Online》发表的研究中，建立了一套标准化流程。研究人员采用蔗糖垫超速离心法从10名健康 donor 混合血浆中初步富集EVs，随后创新性地将荧光染料CFDA-SE（通过酯酶活性标记完整EVs）与流式细胞术联用，配合尺寸排阻色谱(SEC)纯化步骤，系统优化了从喷嘴选择（70μm最佳）、压力参数到荧光触发阈值（设定为300）的全流程。通过纳米颗粒追踪分析(NTA)、透射电镜(TEM)和Western blot等多维验证手段，证实该方法可高效分选CD9⁺、CD63⁺等EV亚群，并成功应用于血小板来源CD42a⁺ EVs的miRNA组学分析。

关键实验技术：

1. 1.

   蔗糖垫超速离心（100,000×g）结合差速离心去除血浆污染物

2. 2.

   CFDA-SE荧光标记与APC-CD9抗体双标策略

3. 3.

   BD FACS Symphony S6流式细胞仪（5激光配置）的阈值触发优化

4. 4.

   尺寸排阻色谱(SEC)去除未结合染料/抗体

5. 5.

   纳米颗粒追踪分析(NTA)和透射电镜(TEM)表征EVs物理特性

研究结果

仪器参数优化

通过比较不同阈值设置发现，阈值设为300时背景噪声(BN)仅占6.4%，而200阈值时飙升至91.87%。70μm喷嘴可在60μL最小体积内完成50,000个CD9⁺ EVs分选，较130μm喷嘴节省6倍体积。NTA显示分选前后EVs中位粒径稳定在181.5±12.7nm vs 164.8±9.7nm。

SEC去污增效

SEC处理后CFSE⁺ EVs占比从40.2%提升至75.2%，背景噪声从44.2%降至14.9%。分选效率提升7倍，7.0×10⁷个CD9⁺ EVs仅需75分钟即可完成。

亚群分选验证

成功分离CD9^Bright（富集度95.3%）与CD9^Dim（97.4%）亚群，以及CD63⁺ EVs（74.5%）。Western blot证实分选后EVs仍表达Alix、Syntenin等内体标记物，且ApoB100脂蛋白污染被有效清除。

血小板EVs应用

从CD42a⁺ EVs中检出16种血小板相关miRNA，其中miR-361-3p表达量超血小板来源100%，凸显该方法在追踪EV细胞来源方面的价值。

结论与展望

该研究建立的"蔗糖离心-荧光触发-SEC纯化"技术链条，首次实现了血浆EVs的高纯度（>95%）、高通量（15K events/s）分选，其创新性体现在：① 通过CFDA-SE酶激活特性区分完整EVs与碎片；② SEC步骤将分选效率提升7倍；③ 兼容多种表面标记（CD9/CD63/CD42a）。这不仅为肿瘤微环境研究提供了CD9⁺ EVs标准化分选方案，更通过血小板EVs的miRNA分析证明其在追溯EV生物发生机制方面的潜力。未来可拓展至循环肿瘤细胞(CTC)衍生EVs分选，推动液体活检技术向单囊泡分辨率迈进。