新型Slc20a2基因敲除小鼠模型的构建及其在原发性脑钙化疾病研究中的应用

本研究针对原发性脑钙化(PBC)的病理机制不明问题，通过CRISPR/Cas9技术构建新型Slc20a2-/-小鼠模型。研究发现纯合子小鼠11月龄时出现特异性脑部钙沉积（5/5），而杂合子无异常（9/9），成功模拟人类PBC脑区局限性钙化特征。该模型为揭示SLC20A2介导的磷酸盐转运障碍与脑钙化关系提供了重要工具，发表于《Molecular Brain》。

　　

研究背景

原发性脑钙化(Primary Brain Calcification, PBC)是一种神秘的神经退行性疾病，患者大脑基底节等区域会出现异常钙盐沉积，伴随帕金森综合征、认知障碍等多样化症状。尽管已发现SLC20A2、PDGFRB等7个相关基因，但约50%病例仍无法用已知基因突变解释。更令人困惑的是，虽然患者全身存在矿物质代谢紊乱，钙化却仅发生于脑部——这种组织特异性机制如同一个精密运作的"生物锁"，至今未被完全破解。2013年首个Slc20a2敲除小鼠的报道为研究打开突破口，但该模型存在外源基因插入干扰等局限性。

关键技术方法

研究团队采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，通过同源定向修复在Slc20a2基因第3外显子插入终止密码子，构建新型敲除小鼠。通过Kossa染色、HE染色等组织学方法系统评估不同月龄小鼠脑部钙沉积特征，并采用免疫组化分析胶质细胞活化标志物GFAP、Iba-1表达。所有实验动物均经Gifu大学动物伦理委员会批准（2020-063）。

研究结果

基因编辑验证

成功建立不携带外源报告基因的Slc20a2^-/-小鼠系，通过MluI酶切和14个潜在脱靶位点测序验证编辑特异性。蛋白印迹显示肾脏和小脑中磷酸盐转运体Pit2表达显著降低。

表型特征分析

纯合子小鼠表现为体型减小和存活率降低。11月龄时所有检测个体（5/5）均出现丘脑、下丘脑等脑区钙沉积，而5月龄个体（2/2）仅见少量沉积。值得注意的是，杂合子小鼠（9/9）尽管Pit2蛋白表达降低50%，却未出现钙化现象。

病理学特征

钙沉积主要分布于血管周围间隙和脑实质，呈同心圆状排列。这些沉积物同时含有钙（von Kossa阳性）和铁（柏林蓝阳性）成分。尽管观察到星形胶质细胞（GFAP⁺）和小胶质细胞（Iba-1⁺）的活化，但周围神经元未出现tau蛋白或α-突触核蛋白异常蓄积。

讨论与意义

该研究创新性地构建了更接近自然基因状态的Slc20a2敲除小鼠，其脑部钙化模式与人类PBC高度相似。三个关键发现尤其值得关注：首先，杂合子小鼠未出现表型，提示单等位基因缺陷可能需更长时间才会显现病理改变；其次，钙铁共沉积现象暗示SLC20A2可能参与多种金属离子的脑内稳态调控；最重要的是，钙化灶周围缺乏典型神经退行性变证据，挑战了"钙化直接导致神经元死亡"的传统认知。

这些发现为PBC发病机制研究提供了重要启示：脑钙化可能独立于神经退行性进程发生，而血脑屏障的特殊微环境或是决定钙化部位特异性的关键因素。该模型将助力于：解析SLC20A2在脑内离子平衡中的作用；筛选靶向钙化过程的治疗药物；探索PBC与其他神经退行性疾病的潜在关联。正如研究者Hisaka Kurita和Hiroki Kitaura强调的，这项研究为破解"为什么钙化只发生在大脑"这个核心谜题提供了新的实验工具和理论框架。