NEDD4-2介导的PLSCR1泛素化调控：肾脏疾病中磷脂紊乱与细胞凋亡的新机制

本研究揭示了NEDD4-2（NEDD4L）通过泛素化修饰调控磷脂 scramblase 1（PLSCR1）蛋白稳定性的新机制。研究人员采用蛋白质组学筛选发现PLSCR1是肾脏细胞中NEDD4-2的新作用靶点，证实其PY基序依赖的相互作用可促进PLSCR1降解。NEDD4-2缺失导致PLSCR1积累，增强钙离子和凋亡刺激下的磷脂酰丝氨酸（PS）外翻及巨噬细胞清除效率，为理解慢性肾脏病（CKD）中肾小管细胞凋亡提供了新视角。

　　

在肾脏生理和病理过程中，蛋白质泛素化修饰扮演着关键角色。NEDD4-2（NEDD4L）作为HECT型E3泛素连接酶家族成员，已知通过调控上皮钠通道（ENaC）等膜蛋白影响钠离子平衡。先前研究发现肾脏特异性敲除Nedd4-2的小鼠会出现进行性肾小管损伤，表现为慢性肾脏病（CKD）样病理特征，但除已知的离子通道调控外，其他潜在分子机制尚不明确。与此同时，磷脂 scramblase 1（PLSCR1）作为能催化磷脂酰丝氨酸（PS）膜外翻的多功能蛋白，其异常活化与细胞凋亡和巨噬细胞清除密切相关，然而其上游调控机制仍是未解之谜。

这项发表在《Cell Death Discovery》的研究，通过系统性筛选发现了PLSCR1是NEDD4-2的新型底物，阐明了二者在肾脏细胞凋亡调控中的分子机制。研究人员采用亲和纯化质谱技术鉴定肾脏细胞中NEDD4-2的相互作用蛋白，结合免疫共沉淀和体外泛素化实验验证PLSCR1的PY基序依赖性相互作用；通过构建诱导型NEDD4-2敲除细胞系，利用钙离子载体A23187和凋亡诱导剂（依托泊苷/顺铂）处理，采用流式细胞术检测PS外翻；建立THP-1巨噬细胞共培养体系，使用pH敏感染料定量吞噬清除效率；并分析肾脏特异性Nedd4-2^Ksp1.3敲除小鼠的肾脏组织样本。样本来源包括小鼠皮质集合管细胞系（CCD）、HEK293T细胞及基因工程小鼠模型。

PLSCR1作为NEDD4-2的新候选底物

蛋白质组学分析显示PLSCR1是NEDD4-2免疫沉淀物中最富集的蛋白之一。序列分析发现小鼠PLSCR1含有保守的PPxY基序（AlphaFold结构预测显示其可及性），这是NEDD4-2WW结构域的典型结合位点。在NEDD4-2敲除的CCD细胞中，PLSCR1蛋白水平显著升高；蛋白酶体和溶酶体抑制剂处理也导致PLSCR1积累，提示其通过泛素-蛋白酶体途径降解。

NEDD4-2与PLSCR1相互作用并介导其泛素化

免疫共沉淀证实NEDD4-2与PLSCR1存在直接相互作用。体外泛素化实验显示野生型（WT）NEDD4-2能有效催化PLSCR1泛素化，而催化失活的半胱氨酸突变体（CM）则无此活性。值得注意的是，虽然PY基序突变（Y→A）仍保留部分结合能力，但其泛素化效率显著降低，表明稳定的PY基序介导的结合对有效泛素化至关重要。

NEDD4-2调控钙激活的PLSCR1 scramblase活性

钙离子载体A23187处理后，NEDD4-2敲除细胞显示更强的Annexin V结合信号（反映PS外翻水平），且该表型可通过恢复NEDD4-2表达而逆转。免疫印迹证实PS外翻程度与PLSCR1蛋白水平正相关，首次将NEDD4-2的泛素化调控与PLSCR1的钙依赖性功能联系起来。

NEDD4-2缺失增强凋亡诱导的PLSCR1活性

依托泊苷和顺铂处理诱导凋亡时，NEDD4-2敲除细胞表现出更显著的PS外翻，且巨噬细胞对凋亡细胞的清除效率在24小时后显著提高（pHrodo吞噬实验证实）。值得注意的是，细胞存活率分析排除凋亡速率差异的影响，表明表型差异源于PLSCR1介导的PS信号增强。

NEDD4-2缺陷小鼠肾脏中PLSCR1水平升高

在肾小管特异性Nedd4-2^Ksp1.3敲除小鼠中，正常盐饮食下肾脏PLSCR1蛋白即显著增加；高盐饮食进一步降低NEDD4-2水平时，PLSCR1呈现上升趋势，与体外结果一致。该发现将细胞机制与整体动物病理表型相关联。

这项研究首次确立PLSCR1作为NEDD4-2泛素化的新底物，拓展了对肾脏疾病中离子平衡与非离子通道蛋白调控网络的认识。从机制层面，揭示NEDD4-2通过PY基序依赖性相互作用促进PLSCR1降解，从而精细调控其介导的PS外翻和凋亡细胞清除过程。在病理意义上，为理解NEDD4-2缺失导致的肾小管损伤提供新解释——除已知的钠离子通道失调外，PLSCR1积累可能通过增强凋亡信号传递加剧组织损伤。特别值得注意的是，该研究突破传统认知，证明即使在TMEM16F等冗余 scramblase存在的情况下，PLSCR1水平的生理性变化仍可产生可测量的功能输出，暗示其调控具有细胞类型特异性。这些发现不仅为慢性肾脏病治疗提供潜在新靶点，也为病毒感染（PLSCR1的已知功能领域）等病理过程中泛素化调控研究开辟新方向。