一种基于非对称照明和深度学习加速技术的增强型虚拟相位对比方法，用于明场显微镜观察

《Optics and Lasers in Engineering》：An enhanced virtual phase contrast method for brightfield microscopy based on asymmetric illumination and deep learning acceleration

虚拟相位对比显微镜通过圆柱透镜调制照明光波矢分量，结合数据驱动的条件生成对抗网络（CGAN）实现无标记样本的高质量成像，在细胞计数和分割任务中展现出优于传统相位对比显微镜的对比度和细节保留能力。

　　

全宏达|孔凌宝|王一帆|张申岩|欧阳浩|郑金莲

复旦大学未来信息技术学院超精密光学制造工程研究中心，上海200433，中国

摘要

明场显微镜仍然是生物医学研究中的重要工具。然而，在对未染色样本进行无创成像时，其提供清晰图像的能力有限。尽管标准相位对比显微镜可以解决这一问题，但需要匹配的环形光阑和物镜增加了系统的复杂性和成本。此外，环形光阑对光线的限制导致图像变暗，给图像采集带来了挑战。为了克服这些挑战，本文提出了一种基于非对称照明和深度学习加速的增强型虚拟相位对比（VPC）方法，结合了明场显微镜和相位对比显微镜的优点，同时减轻了各自的局限性。通过使用圆柱透镜调节照明光的波矢分量，解决了直接从缺乏相位信息的明场图像生成虚拟相位对比图像的不可靠性问题。此外，还采用了一个带有置信图的数据驱动条件生成对抗网络（CGAN）来加速明场显微镜图像向VPC图像的转换。实验结果表明，重建的VPC图像在图像质量上与传统DPC图像相当，在某些情况下，在对比度和细节保留方面甚至优于后者。此外，该方法在细胞计数和分割等应用中表现出色，为无需专用相位对比设备的情况下增强了明场显微镜图像的质量。

引言

显微镜在生物学和医学中对于研究生物样本至关重要[[1], [2], [3]]，但大多数样本是透明或半透明的[4,5]，这使得使用传统明场显微镜进行分析变得复杂。染色技术常用于提高可见性[[6], [7], [8], [9]]，从而改善对比度并便于观察，但它们可能会损坏样本，不适合活体样本的观察[4,[10], [11], [12]]。这催生了非破坏性方法的需求。泽尼克相位对比显微镜[13]利用厚度或折射率变化引起的相位偏移来揭示以前不可见的细节，彻底改变了生物成像技术。传统的相位对比显微镜通常需要精确匹配的相位板和物镜才能达到最佳成像效果，这增加了系统的复杂性和成本。此外，环形光阑显著减少了入射光量，给图像采集带来了挑战。虽然已经提出了一些方法来提高相位对比显微镜的成像性能，例如优化环形光阑[14]、改进相位板[15]或使用LED编码阵列进行照明[16,17]，但这些修改往往需要对光学路径进行昂贵且技术要求高的调整，限制了其在生物医学领域的应用。

除了使用相位对比显微镜来观察未染色样本外，利用深度学习来增强明场显微镜图像也是一种解决方案。近年来，深度学习的快速发展为传统光学成像技术开辟了新的可能性。这种变革性的方法已成功应用于多个领域，包括荧光超分辨率成像[18]、通过散射介质的成像[19]、数字全息重建[20]和傅里叶衍射成像[21]。在利用深度学习增强明场显微镜图像方面，刘等人提出了一种使用循环生成对抗网络（cycle GAN）直接将明场图像转换为相位对比图像的方法[22]。这种方法方便高效；然而，从缺乏相位数据的强度图像中恢复相位信息存在一定的挑战。边等人采用了一种不同的策略，利用环形光阑、单个透镜和智能手机相机，并结合深度学习网络来实现相位对比效果[23,24]。尽管这种方法具有简单性和便携性的优点，但它与传统明场显微镜的集成度不高，限制了其在某些场景中的适用性。

为了解决上述问题，本文提出了一种基于非对称照明和深度学习加速的增强型虚拟相位对比（VPC）方法。该方法结合了明场显微镜和相位对比显微镜的优点，同时减轻了各自的局限性。通过使用圆柱透镜调节照明光的波矢分量，解决了直接从缺乏相位信息的明场图像生成VPC图像的不可靠性问题。此外，还采用了一个带有置信图的数据驱动条件生成对抗网络（CGAN）来加速明场显微镜图像向VPC图像的转换。VPC图像使用标准图像质量评估方法进行了评估，并在特定应用（如细胞检测和细胞分割）中进行了进一步分析。

圆柱透镜增强虚拟相位对比原理

图示展示了我们提出的方法、传统明场显微镜和相位对比显微镜的光学结构。如图1(b)所示，明场显微镜利用光源通过聚光器准直形成平行光束，为样本提供科勒（K?hler）照明。来自样本的散射光随后被物镜收集并在相机传感器平面上形成图像。然而，均匀照明会降低图像对比度，

系统设置

系统的结构如图5a和5b所示，其中使用了一种标准的商用倒置生物显微镜（Mshot, MI52-N）。光源通过聚光器组准直并以科勒照明配置定向。一个焦距为75毫米的圆柱透镜（Daheng Optics, GCL-110-116）放置在距离样本20毫米的位置，在样本上形成一个椭圆形光斑，如图6d所示。圆柱透镜安装在一个可旋转的支架上

圆柱透镜对照明的调节

为了验证加入圆柱透镜是否可以向强度图像中引入额外信息，我们分别在没有和有圆柱透镜的情况下捕获了明场图像。此外，还在圆柱透镜旋转0°、45°、90°和135°的情况下获取了图像，在旋转过程中透镜的平面始终与样本平面平行，且透镜的光轴保持垂直于样本。结果如图6a所示，揭示了

结论

显微镜在各种生物和医学应用中起着关键作用，尤其是相位对比显微镜，它允许观察透明、未染色的生物样本。然而，传统的相位对比显微镜需要成对的环形光阑和相位对比物镜，显著增加了系统的复杂性和成本。此外，环形光阑限制了光线的摄入，给图像采集带来了挑战。我们的研究提出了一种增强的虚拟

资助

国家自然科学基金（52375414）和上海市科学技术委员会（23ZR1404200）。

数据可用性

本文所述结果所基于的数据目前尚未公开，但可根据合理请求从作者处获得。

CRediT作者贡献声明

全宏达：撰写——原始草稿、软件、方法论、调查、数据管理、概念化。孔凌宝：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、方法论、资金获取、概念化。王一帆：可视化、验证、软件、调查、正式分析、数据管理。张申岩：可视化、验证、资源管理、数据管理。欧阳浩：资源管理、数据管理。郑金莲：资源管理、数据管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们想感谢复旦大学的马炯教授和他的博士生侯端涛先生，感谢他们在实验室中提供相位对比显微镜的支持以及帮助获取数据集。