乳清源细胞外囊泡的大规模分离技术及其在药物递送系统中的治疗潜力研究

本研究针对牛奶源细胞外囊泡(EVs)分离方法可扩展性差的问题，系统评估了超速离心(UC)、切向流过滤(TFF)和聚乙二醇(PEG)共沉淀等技术在乳制品副产物——奶酪乳清中的应用。研究发现乳清可作为可持续EV来源，其TFF和PEG法能有效富集EVs，且负载miRNA的EVs在胃肠稳定性与组织靶向性方面显著优于游离miRNA，为基于EVs的口服给药系统开发提供了关键技术支撑。

　　

在生物医药领域，细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)因其天然的生物相容性和靶向性成为药物递送系统研究热点。牛奶作为EVs的丰富来源，每年全球产量近10亿吨，但其分离面临巨大挑战——牛奶中直径70-200nm的酪蛋白胶束与EVs在物理特性上高度重叠，而传统超速离心(Ultracentrifugation, UC)方法存在能耗高、规模受限等问题。更棘手的是，口服给药时核酸类药物易被胃肠道降解，如何突破这些技术瓶颈成为学界关注焦点。

来自西班牙IMDEA食品研究所的Alberto Dávalos团队在《Pharmacological Research》发表重要研究，创新性地将目光投向奶酪工业副产品乳清。通过系统比较牛、羊、山羊三种乳清源EVs的分离纯化策略，研究团队发现经凝乳酶处理的乳清天然去除了大部分酪蛋白，结合切向流过滤(Tangential Flow Filtration, TFF)或聚乙二醇(Polyethylene Glycol, PEG)沉淀等可扩展技术，能高效获得药用级EVs。更令人振奋的是，负载miR-215-5p的乳清EVs在模拟消化实验中展现出比游离miRNA高10倍的稳定性，小鼠实验证实其可有效递送至心脏、脾脏等靶组织。

研究采用多学科技术联用策略：通过差速离心预处理样本后，对比UC、TFF和PEG三种EVs富集方法，结合尺寸排阻色谱(Size Exclusion Chromatography, SEC)进行精细纯化；采用纳米颗粒追踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)表征颗粒特性，Western blot验证标志蛋白(TSG101、CD63等)；建立体外胃肠消化模型评估miRNA稳定性，并通过小鼠口服给药实验分析组织分布。所有动物实验均符合欧盟2010/63/EU指令规范。

研究结果部分揭示多个重要发现：

3.1 牛奶EVs分离与表征

双次UC循环可显著减少酪蛋白污染，SEC纯化后EVs标志物TSG101/CD63表达提升3倍。电镜显示EDTA处理能解离酪蛋白胶束而不破坏EVs完整性，为预处理提供新方案。

3.3 乳清作为替代EVs来源

比较三种乳源发现，牛乳清EVs得率最高（达1.5×10¹¹颗粒/mL），且天然酪蛋白残留量比牛奶低80%。创新性发现乳清酸化为pH4时，蛋白污染物去除率达75%，但EVs标志物CD63信号减弱，提示需优化pH阈值。

3.6 可扩展分离技术评估

TFF与PEG法在EVs富集效率上与UC相当，但SEC分析显示前者会共捕获乳清蛋白（如β-乳球蛋白）。值得注意的是，PEG处理使EVs的zeta电位从-25mV降至-18mV，可能影响体内递送效率。

3.7-3.8 功能验证

突破性数据显示：EVs包裹使miR-215-5p在模拟肠液中的存活率从0.1%提升至1%；小鼠实验证实口服6小时后，心脏组织miRNA水平仍比对照组高50倍，脾脏富集度达35倍，但肝脏摄取有限，提示天然靶向性差异。

讨论部分强调，该研究首次系统论证奶酪乳清作为"绿色"EVs来源的工业价值。相比牛奶，乳清分离工艺减少2步离心操作，能耗降低60%，符合"One Health"理念。作者特别指出，TFF联合SEC的方案每小时可处理24L乳清，满足GMP生产需求，而PEG法虽成本更低，但需警惕蛋白污染对免疫原性的潜在影响。

这项研究为生物制药行业提供了关键解决方案：一方面将食品工业废料转化为高附加值产品，另一方面建立可放大的EVs制备流程。未来研究可进一步优化乳清EVs的载药效率，并探索其跨越血脑屏障的潜力。正如通讯作者Dávalos强调："乳清EVs就像自然设计的纳米胶囊，我们只是发现了开启它们医疗潜力的钥匙。"论文中建立的标准化流程，为推进EVs药物临床转化奠定了方法学基础。