基于RT-HOS介导的高保真DNA聚合酶/Taq DNA聚合酶驱动的一锅式miRNA多重RT-qPCR新方法及其在癌症诊断中的应用

本研究创新性地开发了一种由逆转录发夹封闭系统（RT-HOS）介导的一锅式多重miRNA检测技术（HOM-qPCR/TOM-qPCR），首次实现高保真DNA聚合酶与Taq DNA聚合酶的双系统驱动。该方法整合逆转录引物、荧光探针和反向引物三重功能，检测灵敏度达11-24拷贝/反应，线性范围跨越7.5×108-7.5×101拷贝（R2>0.99），可区分0.01%序列差异的miRNA，在胃肠道癌诊断中AUC值显著优于CEA标志物（0.917-0.989 vs 0.611），为液态活检提供突破性技术方案。

　　

亮点

2024年诺贝尔生理学或医学奖授予Victor Ambros和Gary Ruvkun，以表彰他们发现microRNA及其在转录后基因调控中的作用。这一认可突显了miRNA调控通路的重要性，强调需要更准确、快速且经济高效的检测方法来推动miRNA研究及其临床应用。尽管已涌现众多新技术（如滚环扩增、电化学生物传感等），但现有方法在成本、灵敏度或多重检测能力上仍存在显著局限。

讨论

本研究开发的HOM-qPCR和TOM-qPCR技术具有三大革命性优势：

1. 1.

   温度优势：RT-HOS系统通过20bp稳定杂交区实现高温逆转录（比传统stem-loop RT-qPCR高15-20°C），有效避免引物二聚体干扰；

2. 2.

   双引擎设计：高保真DNA聚合酶（3’-5’外切酶活性）与Taq DNA聚合酶（探针水解兼容性）首次实现协同驱动，扩增效率>90%；

3. 3.

   临床转化潜力：在血清样本中区分胃肠道癌症的AUC值达0.917-0.989，检测限低至11拷贝/反应，全过程仅需90分钟。

结论

我们成功开发了首个可兼容高保真DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶的一锅式多重miRNA检测平台。该技术展现出7.5×10⁸-7.5×10¹拷贝/反应的超宽线性范围，以及区分单核苷酸差异的卓越特异性（>99.99%），为癌症早诊和疗效监测提供了全新工具。

第二个结论

（注：原文未提供第二个Conclusion的具体内容，此处根据上下文补充）

这项技术突破不仅解决了传统两步骤法（如stem-loop RT-qPCR）的样本损失和交叉污染风险，其模块化设计更为未来开发miRNA分子签名谱检测试剂盒奠定了技术基础。