小分子BRD1732的细胞内特异性泛素化：一种新型蛋白质翻译后修饰机制

这篇突破性研究首次报道了合成小分子BRD1732在细胞内被E3泛素连接酶（RNF19A/B）直接泛素化的现象。通过CRISPR筛选和蛋白质组学分析，作者发现该小分子的氮杂环丁胺次级胺与泛素C端形成共价连接，产生非典型K27连接的二泛素链，导致泛素-蛋白酶体系统（UPS）功能紊乱。这一发现拓展了蛋白质翻译后修饰（PTM）的认知边界，为开发基于小分子的泛素化调控策略提供了全新思路。

　　

BRD1732是依赖RNF19A/B的立体特异性细胞毒素

从立体多样性合成（DOS）文库中筛选出的氮杂环丁胺类化合物BRD1732展现出独特的立体特异性细胞毒性，其(2S,3R,4R)立体异构体的半数抑制浓度（IC₅₀）为1-3 μM，而差向异构体活性降低10-40倍。全基因组CRISPR筛选揭示该效应高度依赖RBR型E3泛素连接酶RNF19A/B及其共享E2结合酶UBE2L3。PRISM平台在580种癌细胞系中的分析证实，RNF19A表达水平与BRD1732敏感性显著相关。

小分子直接泛素化的确证

免疫印迹显示BRD1732处理导致单泛素和双泛素物种异常积累，伴随单泛素分子量微小偏移。液相色谱-质谱（LC-MS）检测到内源性泛素分子量增加387 Da，精确匹配泛素-BRD1732共价加合物的理论值。胰蛋白酶消化实验进一步捕获到Gly-Gly-BRD1732特征片段（m/z=519），质谱碎裂谱图证实该加合物通过泛素C端与氮杂环丁胺环的次级胺形成酰胺键。甲基化修饰实验表明，氮原子甲基化（BRD-NMe）完全阻断泛素化，而羟基甲基化（BRD-OMe）无影响。

泛素化机制的分子基础

在RNF19A/B双敲除（DKO）细胞中，BRD1732诱导的泛素化现象几乎完全消失。外源表达野生型RNF19A或RNF19B可恢复泛素化活性，但缺失RING2结构域催化半胱氨酸（C316）的突变体则无效。值得注意的是，BRD1732处理显著提高RNF19蛋白稳定性，暗示其可能通过变构效应调控E3连接酶活性。UBE2L3敲除同样大幅削弱泛素化效应，证实经典泛素级联反应的参与。

对泛素-蛋白酶体系统的多层面干扰

定量蛋白质组学揭示BRD1732产生双向调控效应：225种蛋白显著积累（包括p21、p27等典型蛋白酶体底物），94种蛋白减少，其中63种与蛋白酶体抑制剂MG132的稳定蛋白重叠。深度覆盖机制分析（DeepCoverMOA）显示其蛋白组学特征与MLN4924（NEDD8活化酶抑制剂）相关性最高（r=0.48）。特别引人注目的是K27连接的二泛素-BRD1732加合物异常积累，该罕见连接类型通常参与核蛋白的p97依赖性加工。点击化学实验证实炔烃修饰的BRD1732（BRD-alkyne）可捕获K27连接的二泛素物种。

特异性抑制泛素依赖性降解

在IKZF3-GFP报告系统中，BRD1732预处理（非共处理）有效阻断来那度胺诱导的CRBN依赖性降解。TNF刺激实验显示，BRD1732通过维持IκBα磷酸化和泛素化但阻断其降解，表明作用位点在蛋白酶体识别阶段。不同于典型蛋白酶体抑制剂，BRD1732不影响鸟氨酸脱羧酶（ODC）等泛素非依赖性底物的降解，但诱导ZFAND5/6等锌指蛋白的RNF19依赖性降解，暗示存在独特的底物选择性。

理论突破与转化价值

该研究首次证实小分子可作为生理性泛素化受体，突破了对翻译后修饰的传统认知。BRD1732的氮杂环丁胺骨架模拟了蛋白质赖氨酸的ε-氨基，但以次级胺形式实现泛素化，这为设计双功能分子引导靶蛋白泛素化提供了模板。K27连接的二泛素加合物表现出特殊的代谢稳定性，可能成为研究该稀有链类型的工具分子。从转化医学角度看，这一发现为开发新型蛋白酶体调控剂和分子胶降解剂开辟了道路，特别是在RNF19高表达的肿瘤治疗中具有潜在应用价值。