启动子和增强子依赖的cohesin装载通过染色体环化折叠Tcrb基因座实现长程V(D)J重组

本研究揭示了抗原受体基因Tcrb在淋巴细胞发育过程中三维结构组装的分子机制。研究人员通过整合遗传学与多组学方法，发现Vβ启动子和Eβ增强子分别从基因座两端引导cohesin复合体装载，启动双向的染色质环挤出(LE)，协同CTCF结合元件(CBE)形成长程染色体环，从而促进远端Vβ与DJβ片段的重组。该发现为理解基因组拓扑结构动态调控提供了新范式，对免疫系统发育和基因组稳定性研究具有重要意义。

　　

在淋巴细胞发育过程中，抗原受体基因需要通过V(D)J重组机制将分散在数百万碱基对范围内的基因片段进行精确组装。这一过程面临的核心科学问题是：线性距离如此遥远的DNA片段如何被时空特异性地拉近并完成重组？其中T细胞受体β链(Tcrb)基因座作为模型系统，其长达650kb的基因组区域如何折叠成功能性三维结构，一直是领域内亟待破解的谜题。

传统观点认为，染色质的同型互作和环挤出(loop extrusion, LE)是促成长程DNA互作的两大机制。然而，这些机制如何被特定的顺式调控元件（如启动子和增强子）精确控制，以及它们对免疫受体基因多样性的贡献程度仍不清楚。特别是当研究发现不同抗原受体基因（如Igh、Igk和Tcrb）采用明显不同的拓扑结构时，更凸显了阐明这些机制的重要性。

在这项发表于《Cell Reports》的研究中，由Brittney M. Allyn和Katharina E. Hayer等领衔的多机构团队，通过对Tcrb基因座进行系统性遗传改造和三维基因组学分析，揭示了启动子与增强子协同调控染色体环化的新颖机制。研究人员创造性地利用基因编辑技术构建了系列小鼠模型，包括Trbv1启动子截短突变体(V1T^xS)、DJβ区CTCF结合元件(CBE)缺失体(5'PC^KO、C1^KO、C3^KO及三突变体513T^KO/TKO)，以及Eβ增强子敲除模型(Eβ^KO/KO)。

关键技术方法包括：

1. 1.

   微捕获C技术(MicroCapture C, MCC)高分辨率解析Tcrb三维互作网络

2. 2.

   染色质免疫共沉淀测序(CUT&RUN)分析CTCF、cohesin亚基RAD21和装载因子NIPBL的基因组分布

3. 3.

   全局核糖核酸延伸测序(GRO-seq)监测转录活性

4. 4.

   适应性免疫测序(Adaptive Immunosequencing)定量V(D)J重组频率

5. 5.

   PHI-C算法将Hi-C数据转化为三维动态模型

研究结果部分的重要发现如下：

Vβ启动子通过cohesin装载驱动长程Vβ-RC互作

通过比较野生型与V1T^xS/TxS突变体发现，Trbv1启动子（而非转录延伸过程）对NIPBL和RAD21在Trbv1 3'CBE的装载至关重要。这种装载能启动环挤出过程，形成从Vβ向重组中心(RC)延伸的"条纹状"互作模式。值得注意的是，虽然转录延伸受阻导致成熟T细胞中Trbv1表达降低，但不影响其在DN胸腺细胞中的重组频率。

DJβ CBEs调控Vβ和Dβ-Jβ片段使用

缺失实验显示5'PC和CBE1共同调控远端Vβ片段的使用，而CBE1还特异性影响DJβ1的转录和重组。引人注目的是，三突变体513T^KO/TKO表现出近端Vβ片段(如Trbv30)使用频率的显著增加，证实这些CBEs在维持平衡的TCRβ组库中的关键作用。

DJβ CBEs作为染色体环锚定点的多重功能

三维基因组分析揭示DJβ CBEs具有三种功能：(1)终止来自Vβ簇的LE；(2)在RC内启动LE；(3)作为绝缘子限制Eβ活性。当所有三个CBEs缺失时，Eβ的活性会异常扩展到邻近的非Tcrb基因（如Prss2和Ephb6），同时Vβ与RC的互作模式发生重构，更多转向DJβ2-Eβ区域。

Eβ对RC区cohesin装载的必要性

尽管Eβ缺失导致DJβ区cohesin装载几乎完全消失，但令人惊讶的是，Vβ与RC之间的长程互作仍得以维持。这表明从Vβ端启动的单向LE足以维持基因座的基本折叠，而Eβ主要功能是激活RC染色质和调控局部互作。

在讨论部分，作者提出了Tcrb折叠的"双向环挤出"模型：Vβ启动子从基因座5'端，Eβ从3'端分别引导cohesin装载和LE，通过汇聚于中间的CBEs形成稳定的染色体环。这种冗余机制确保了即使某一通路受阻，仍能维持足够的V(D)J重组效率，从而保障免疫组库的多样性。与Igh基因座主要依赖单向扫描机制不同，Tcrb采用的双向系统更有利于通过随机扩散实现片段间的有效碰撞。

该研究的突破性意义在于：首次阐明启动子作为cohesin装载位点的新功能，揭示了增强子与CTCF元件协同塑造三维基因组的多层次调控机制。这些发现不仅深化了对免疫受体基因组装原理的认识，也为理解更广泛的基因组组织规律提供了新视角。在应用层面，研究揭示的拓扑调控机制可能解释某些免疫缺陷疾病的分子基础，并为合成生物学中人工基因回路的空间组织设计提供借鉴。