聚焦HIV融合肽的免疫定向策略：恒河猴模型中保守表位疫苗设计新突破

本研究针对HIV-1包膜糖蛋白(Env)高度保守的融合肽(FP)表位，通过精准删除N241糖基化位点增强表位暴露，结合渗透泵缓释递送和异源三聚体加强免疫策略，成功在恒河猴模型中诱导出针对FP的特异性抗体反应。研究采用nsEMPEM（负染色电子显微镜多克隆表位定位）和cryoEMPEM（冷冻电镜多克隆表位定位）技术解析抗体-抗原相互作用，证实异源加强可聚焦体液免疫应答于中和表位。该成果为基于表位保守性的HIV疫苗设计提供了新思路，发表于《npj Vaccines》。

　　

HIV-1病毒通过其包膜糖蛋白(Env)介导细胞融合入侵，其中融合肽(FP)作为高度保守的功能域，是中和抗体的理想靶点。然而，FP被四类典型糖基化位点（N88、N230、N241、N611）遮蔽，且传统疫苗策略难以突破免疫分散效应——抗体常靶向非中和表位而非FP。更棘手的是，既往研究表明，过度删除FP邻近糖链会导致抗体偏向性识别糖链缺失区域，反而限制中和广度。这些挑战催生了本研究的关键科学问题：如何在不破坏天然构象的前提下，精准聚焦免疫应答于FP表位？

为破解这一难题，Payal P. Pratap团队设计了一套创新免疫策略。研究采用嵌合三聚体BG505-CH505ΔN241（仅删除N241糖链）作为初免抗原，通过渗透泵缓释递送延长抗原暴露时间；后续用含完整糖链的同源三聚体BG505-CH505+N241和异源三聚体AMC016（携带BG505 FP序列）加强免疫。这种"温和去糖基化初免+异源加强"的组合拳，旨在平衡表位暴露与天然构象保持。

关键技术方法包括：1) 使用渗透泵实现持续4周的抗原/佐剂缓释；2) 通过nsEMPEM和cryoEMPEM技术绘制多克隆抗体表位图谱；3) 流式细胞术追踪生发中心B细胞(GC B)动态；4) 假病毒中和试验评估血清广度；5) 基于冷冻电镜的结构序列(Structure-to-Sequence, STS)技术反向推导抗体序列。实验对象为12只印度恒河猴，分为实验组（ΔN241初免）和对照组（完整糖链初免）。

FP靶向免疫原设计与免疫方案

研究团队构建的嵌合三聚体巧妙整合了BG505（A亚型）骨架与CH505（C亚型）可变区，既保留关键糖基化位点，又引入新型链间二硫键（501C-L663C）防止三聚体解离。质谱分析显示，C端9x-Flag标签显著提升N656糖基化占据率至75%（3x-Flag标签仅40%），证实延长翻译时间可改善糖链加工。

nsEMPEM检测到异源加强后的FP应答

负染色电镜表位定位显示，ΔN241初免组在异源加强后（第24周）出现FP特异性抗体，而同源加强组直至第39周异源加强后才检测到类似反应。值得注意的是，交叉连接nsEMPEM技术提前揭示了低丰度FP抗体的存在，证明该技术对疫苗设计的预测价值。

流式细胞术揭示GC B细胞有限变化

尽管异源加强后AMC016探针结合的GC B细胞比例短暂升高，但总体GC B细胞和滤泡辅助T细胞(T_FH)比例保持稳定，暗示免疫聚焦主要通过激活既有低亲和力B细胞克隆而非大规模克隆扩增实现。

异源加强后血清中和活性

实验组动物RQk18在异源加强后展现出对6/9 FP敏感假病毒的弱中和活性，但FP竞争实验证实其中和作用非FP依赖。这种"表位漂移"现象提示，ΔN241初免虽未能强效激活FP特异性B细胞，但为异源加强提供了交叉反应基础。

cryoEMPEM解析高分辨率靶向应答

3.1?冷冻电镜结构揭示，RQk18血清中的FP抗体RQk-FP-A通过重链CDR3芳香族残基（类似人类广谱中和抗体PGT151和ACS202）形成疏水口袋，稳定FP N端。与之对比，对照组动物RUu18的"伪FP抗体"仅结合FP邻近的C1/C2区域，凸显糖链删除策略的关键差异。通过STS技术，研究者成功从3.1?图谱反推抗体序列，获得8个FP结合单抗，虽无中和活性，但验证了结构指导抗体发现的可行性。

这项研究的重要意义在于三方面突破：首先，证明单糖链删除（ΔN241）结合异源加强可部分实现免疫聚焦，但需优化初免策略以增强FP特异性B细胞激活；其次，建立了一套从多克隆血清中精准解析表位特异性的技术流程（EMPEM+STS），为疫苗评估提供新工具；最后，揭示糖基化占据不均（如N156）会引发脱靶应答，强调免疫原设计需兼顾表位暴露与糖链完整性。该成果为发展基于保守表位的HIV疫苗提供了重要方法论启示，尽管中和广度仍有提升空间，但证实了"渐进式免疫聚焦"策略的可行性。未来研究可探索多表位协同靶向或组合初免方案，以突破现有局限性。