加速cGMP生产近天然HIV-1 Env三聚体及其免疫原性分析：电穿孔转染技术推动疫苗研发进程

本研究针对HIV-1疫苗开发中Env三聚体稳定性差、生产周期长的瓶颈问题，通过电穿孔转染CHO-S?细胞实现16055 DG4 NFL（去糖基化四联突变天然柔性连接）三聚体的快速cGMP生产。研究团队采用PGT145免疫亲和层析纯化技术，结合冷冻电镜（cryoEM）和生物层干涉（BLI）验证其近天然构象，并通过兔模型证实该三聚体可诱导靶向CD4结合位点（CD4bs）的自体中抗体。该成果为加速HIV疫苗临床评估提供了新范式，相关技术已应用于临床试验（NCT06332339）。

　　

在全球艾滋病防治的持久战中，HIV-1包膜糖蛋白（Env）三聚体因其表面暴露的中和表位而被视为疫苗设计的"圣杯"。然而这种天然不稳定的蛋白质复合物面临三重挑战：生产过程中难以维持预融合构象、糖基化屏蔽关键抗原表位、传统稳定细胞系开发耗时长达8个月。更棘手的是，临床试验中使用的gp120单体疫苗未能提供保护效力，而近期mRNA递送的Env三聚体又出现安全性问题。这些困境促使Scripps研究所团队在《npj Vaccines》发表突破性研究，开发出基于电穿孔转染的加速生产方案。

研究采用四项核心技术：1）MaxCyte^? VLX^?电穿孔系统实现CHO-S?细胞高效转染；2）PGT145单抗亲和层析特异性捕获天然构象三聚体；3）冷冻电镜（cryoEM）3.8?分辨率解析结构；4）兔模型评估三种免疫方案（单次大剂量、阶梯增量、分次接种）的免疫效果。所有实验材料来源于印度C亚型16055毒株，关键突变包括gp120-gp41柔性连接（NFL）、I559P稳定突变及N276Q/N301Q/N306Q/N463Q四联糖基化位点删除（DG4）。

16055 DG4 NFL三聚体的cGMP生产

通过优化电穿孔参数和培养条件，在70L生物反应器中获得75.4mg/L产量。相比传统稳定细胞系方法，该方案将生产周期从12个月缩短至4个月，成本降低5500K美元。病毒清除验证显示，下游工艺对鼠白血病病毒（XMuLV）清除率达14.08 log₁₀，远超监管要求。

结构特征与稳定性验证

冷冻电镜结构揭示关键设计元素：gp120内二硫键（I201C-A433C）锁定CD4结合前构象，V3环区N302Y突变增强热稳定性。差示扫描量热（DSC）显示熔解温度达75℃，SEC-HPLC显示>99%为天然三聚体。值得注意的是，CHO细胞表达的DG4三聚体在N625糖基化位点完全占据，这有助于避免非中和抗体对三聚体基底部的识别。

免疫原性分析

兔实验显示分次接种组在6-8周时中和抗体滴度（ID₅₀）显著高于单次接种组（p<0.01），但最终所有方案均能诱导针对DG4假病毒的CD4bs中和活性。特别的是，部分血清能交叉中和野生型病毒，证明糖基化删除策略可"聚焦"免疫应答于保守表位。

这项研究的意义在于：首先，建立的电穿孔转染平台突破性地将HIV疫苗候选物开发周期缩短67%；其次，DG4设计为克服糖基化屏障提供新思路，其诱导的抗体可穿透"糖盾"识别CD4bs；最后，三聚体在-80℃保存36个月仍保持稳定的特性，极大提升了在资源有限地区的适用性。目前该疫苗作为初免候选物已在HVTN 313临床试验中完成入组，其与异源加强联用的策略可能为广谱中和抗体的产生开辟新途径。正如通讯作者Richard T. Wyatt强调的，这项技术不仅适用于HIV疫苗，还可快速响应其他新发传染病的疫苗需求，代表着下一代重组蛋白疫苗平台的发展方向。