揭示HRK与BCL-XL/BCL-2相互作用的分子机制：BH3模拟物的特异性设计新策略

本研究针对BCL-2家族蛋白抑制剂选择性不足的难题，通过结构生物学与计算生物学手段解析了天然BH3-only蛋白HRK与BCL-XL/BCL-2的结合特异性差异。研究发现BCL-XL的α2-α3区构象动态变化及非保守残基是HRK选择性结合的关键决定因素，并基于此设计出具有纳摩尔级抑制活性的HRK衍生钉合肽，为开发新一代BH3模拟药物提供了重要理论依据。

　　

在细胞凋亡的精密调控网络中，BCL-2家族蛋白如同生命的"开关控制器"，其功能失衡与癌症、神经退行性疾病等多种重大疾病密切相关。尽管靶向BCL-2和BCL-XL的BH3模拟药物（如Venetoclax）已在血液肿瘤治疗中取得突破，但这对高度同源的抗凋亡蛋白（序列相似度达45%）却给选择性抑制剂的开发带来巨大挑战。更令人困扰的是，临床应用中出现的耐药性和血小板毒性等问题，如同悬在研究者头顶的"达摩克利斯之剑"。正是在这样的背景下，天然存在的HRK蛋白（Harakiri）引起了科学家们的特别关注——这个在神经系统中发挥重要凋亡调控作用的BH3-only蛋白，展现出对BCL-XL的显著选择性，但对BCL-2的抑制活性却弱10倍。这种天然的选择性差异背后隐藏着怎样的分子密码？能否从中挖掘出设计精准药物的"密钥"？

为回答这些问题，研究团队采用了多学科交叉的研究策略。通过X射线晶体学解析了BCL-XL/HRK-BH3复合物结构（分辨率2.32 ?），并借助AlphaFold预测了BCL-2/HRK-BH3模型。结合虚拟丙氨酸扫描（BAlaS）和FoldX自由能计算，系统分析了关键残基的相互作用贡献。基于结构洞察，研究人员还设计了系列HRK衍生肽，并通过荧光偏振（FP）实验和圆二色谱（CD）验证了其结合活性与二级结构特征。

Structural mechanism of Harakiri binding to B-cell lymphoma-XL

晶体结构显示HRK的BH3结构域以典型α螺旋插入BCL-XL的疏水沟槽，覆盖约2100 ?²的结合界面。独特的是，HRK在h1位点携带亲水性的Thr33，却能通过水分子介导的氢键网络与BCL-XL的Tyr101形成特殊相互作用。BCL-XL的α3螺旋在结合时发生构象变化，Phe105向外翻转与HRK-Arg36形成阳离子-π作用，这种动态调整使BCL-XL能兼容h1位点的亲水/疏水变异。

The differences in the binding patterns of Harakiri to B-cell lymphoma-XL and BCL-2

比较结构分析发现，BCL-2的α3螺旋在结合HRK时保持稳定构象，其Tyr108和Phe112未发生明显位移。特别值得注意的是，BCL-2的P1口袋更紧凑且疏水性强，这解释了为何BCL-2对HRK-Thr33的耐受性较差（结合亲和力降低10倍）。分子对接预测BCL-2-Asp111可能与HRK-Arg36形成盐桥，但突变实验显示该作用对结合贡献有限。

Effect of BCL-2 and BCL-XL mutations on the interaction with Harakiri-BH3

通过系统突变验证发现，BCL-XL的"热点残基"（Phe105、Tyr101、Glu129）突变可使HRK结合亲和力降低3-10倍；而BCL-2的对应突变（Phe112、Glu136）仅产生2-3倍影响。尤为关键的是，将BCL-XL-Ala104突变为BCL-2同源的Asp后，其与HRK的结合显著减弱，证实该位点的电荷差异是特异性决定因素之一。

Structure-based optimization of Harakiri-derived BH3 peptides

基于FoldX计算的能量优化设计出10种HRK变体肽。其中HRKM7（T33L）对BCL-XL和BCL-2的抑制常数（K_i）分别达<1 nM和36 nM，展现出双靶点抑制潜力。有趣的是，h1位点疏水性越强（如T33L>T33M>T33I），对BCL-2的抑制活性提升越显著，这与BCL-2-P1口袋的疏水特性高度吻合。

Activities of stapled Harakiri-derived peptides toward BCL-XL and BCL-2

通过烯烃复分解反应构建的钉合肽HRKM7-S1/S2，其α螺旋含量提升至50%以上（原肽仅26%）。晶体结构（2.97 ?）显示钉合修饰未改变结合模式，但通过稳定α螺旋构象使抑制活性进入纳摩尔级（IC₅₀ 4.9-12 nM），为后续药物开发提供了优质先导化合物。

这项研究首次在原子层面揭示了HRK与BCL-XL/BCL-2的选择性结合机制，阐明了α2-α3区构象可塑性和非保守残基在结合特异性中的核心作用。特别具有启发意义的是，研究发现BCL-XL能通过构象调整兼容h1位点的亲水性残基，而BCL-2则严格偏好疏水相互作用——这种分子识别特性的差异为设计选择性抑制剂提供了关键靶点。所开发的HRK衍生钉合肽不仅具有优异的双靶点抑制活性，其结构优化策略也可推广至其他蛋白相互作用体系。

该成果对解决BH3模拟药物开发中的选择性难题具有双重意义：一方面为现有药物（如Venetoclax）的耐药性问题提供了结构基础，另一方面为针对实体瘤中BCL-XL过表达的联合治疗策略开辟了新途径。论文中揭示的"构象可塑性决定结合特异性"规律，可能成为未来蛋白-蛋白相互作用抑制剂设计的普适性原则。这项发表在《iScience》的工作，堪称结构药理学与化学生物学完美结合的典范。