XPRESSO技术：模块化抗沉默载体实现人类多能干细胞快速基因工程与持久过表达

为解决人类多能干细胞(hPSCs)基因工程中存在的表观遗传沉默、效率低下等问题，Yehuda Wexler团队开发了XPRESSO系统——一种结合模块化抗沉默转座子载体与高效转染流程的新方法。该技术能在1-2周内建立稳定表达光遗传学蛋白、Cas9、shRNA等多种分子的hPSC系，并在未分化细胞及分化的心肌细胞、神经元中维持长期功能表达，为干细胞研究提供了强大工具。

　　

在干细胞研究与再生医学领域，人类多能干细胞(hPSCs)的基因修饰是探索发育机制、疾病建模和治疗开发的关键工具。然而现有技术面临三大瓶颈：表观遗传沉默导致转基因表达不稳定、操作流程复杂耗时、以及难以实现大片段基因的持久表达。尤其当涉及光遗传学通道等"难表达"蛋白时，这些问题更为突出。这些限制严重阻碍了hPSCs在基础研究和临床转化中的应用。

为突破这些限制，Technion-Israel Institute of Technology的Yehuda Wexler团队在《Stem Cell Reports》发表了创新性研究。研究人员开发了名为XPRESSO（expedited persistent and robust engineering of stem cells with sleeping beauty for overexpression）的系统，将优化的Sleeping Beauty(SB)转座子载体与简化工作流程相结合。该系统包含三个关键技术创新：引入泛染色质开放元件(UCOE)抵抗表观沉默、采用CAG启动子增强表达稳定性、加入WPRE元件提高转录本稳定性。

研究采用化学转染结合SB100X转座酶，建立了包含EGFP、光遗传通道CoChR、shRNA等六种转基因的30余种hPSC系。通过流式细胞术、膜片钳、光学标测等技术，系统评估了转基因在未分化hPSCs及分化的心肌细胞(hPSC-CMs)、神经元中的表达与功能。

优化hPSCs基因工程的工作流程

研究人员首先建立了高效转染体系，使用双顺反子SB转座子载体与超活性SB100X转座酶，通过化学转染在4-7天内即可获得100%阳性的多克隆群体。实验证明，该方法无需细胞分选或电转仪等专业设备，且避免了繁琐的克隆挑选步骤。

转基因在hPSCs和心肌细胞中的功能验证

EGFP-hiPSCs在>150天的培养中保持稳定表达，分化的心肌细胞显示正常电生理特性。靶向EGFP的shRNA在NKX2.5启动子驱动的hESC-CMs中实现87%的mRNA敲降。光遗传学CoChR-hiPSC-CMs表现出典型的光激活电流，并能通过光照调控动作电位。特别值得注意的是，基于XPRESSO-CoChR细胞构建的心脏细胞片(CCSs)可实现光学起搏，并能有效终止转子样心律失常。

基因特异性表观沉默与抗沉默策略

研究发现EGFP与CoChR表达存在显著差异：EGFP保持稳定表达，而CoChR在14代(~60天)内几乎完全沉默。通过引入UCOE元件，使P11时EGFP阳性细胞增加340%，平均荧光强度提高79%。最终优化的XPRESSO载体在25代(~100天)内几乎无沉默，分化的神经元在3个月后仍保持功能表达。

XPRESSO载体支持多种转基因的稳定表达

研究人员构建了XPRESSO-CaViar(钙电压双功能指示剂)和XPRESSO-Cas9两种载体。后者建立的单克隆Cas9-hiPSC系在转染sgRNA后6天内，无需筛选即可实现94%的EGFP敲除效率。靶向KCNH2基因的敲除成功模拟了长QT综合征2型(LQT2)表型，CCSs的动作电位时程(APD₉₀)显著延长至395.93±18.03 ms。

这项研究的意义在于：XPRESSO系统解决了hPSCs基因工程中长期存在的表观沉默难题，特别是对光遗传学工具等难表达蛋白实现了>100天的稳定表达。其简化的工作流程使实验室在常规条件下即可在1-2周内建立转基因hPSC系。研究人员还构建了包含Cas9、CaViar等实用工具的载体库，这些资源将极大促进干细胞在疾病建模、药物筛选和基因治疗等领域的研究应用。该技术的另一个重要突破是首次在hPSC-CMs中实现了足够强的光遗传学电流，能够完成临床相关的"光学除颤"操作，为心脏光电治疗研究开辟了新途径。