双位点选择性交联与冷冻电镜解析结核分枝杆菌分枝酸合酶动态催化机制

研究人员针对结核分枝杆菌分枝酸合酶(MAS)结构动态解析难题，创新性开发双位点选择性交联技术结合冷冻电镜，成功捕获KS-ACP和DH-ACP两种催化状态的高分辨率结构，揭示迭代型I型聚酮合酶(PKS)通过构象扭曲实现底物定向传递的分子机制，为抗结核药物设计提供新靶点。

　　

结核分枝杆菌感染全球25%人口，每年造成150万人死亡，其细胞膜关键成分分枝蜡酸酯(PDIM)占菌体脂质的46%，是致病性和免疫逃逸的核心因子。分枝酸合酶(MAS)作为I型迭代聚酮合酶(PKS)，负责合成PDIM前体分枝酸，但因其448kDa超大分子量和动态催化特性，传统结构解析方法难以捕捉其完整构象。现有抗结核药物异烟肼通过靶向脂肪酸合成途径发挥作用，揭示MAS精确结构将为开发新型抗结核药物提供关键依据。

研究团队创新性整合化学交联与冷冻电镜技术，通过设计α-溴代酰胺交联探针1，在酰基载体蛋白(ACP)与酮缩合酶(KS)或脱水酶(DH)间建立共价连接，成功捕获MAS四种催化状态。关键技术包括：(1)开发可同时靶向KS和DH的双功能交联探针；(2)优化化学酶法加载策略提高交联效率；(3)采用单颗粒冷冻电镜解析交联复合体；(4)构建系列点突变体验证关键相互作用。研究对象为结核分枝杆菌H37Rv菌株表达的MAS全酶及其截短突变体。

研究结果：

1. 1.

   MAS结构整体架构

   解析3.9?分辨率全酶结构显示，MAS形成同源二聚体，包含两个独立催化腔室：缩合腔室(KS-LD-AT)负责链延伸，修饰腔室(DH-ΨKR-ER-KR)完成还原反应。交联使ACP与KS/DH相互作用区域分辨率显著提升，首次清晰观察到ACP helix 2与KS Glu79/AT Asp819的关键氢键网络。

1. 1.

   KS门控机制

   发现KS通过Thr279/Thr281构成的"门环2"与ACP Asp2045相互作用调控底物通道，突变体Thr281Ala完全丧失交联活性。与II型PKS不同，MAS采用Met417替代苯丙氨酸作为门环1残基，适应甲基丙二酰-CoA延伸单元的特性。

2. 2.

   DH构象重排

   捕获3.7?分辨率ACP=DH复合体，显示DH结构域通过30°旋转使活性中心His929暴露，该构象变化由ACP与连接肽L2的Thr2072-Asn933氢键触发。与大肠杆菌FabZ不同，MAS-DH缺乏传统门控残基，依赖域间运动控制底物进出。

3. 3.

   双交联复合体D的动态过程

   6.2?分辨率结构揭示不对称催化状态：一个ACP结合KS进行缩合反应，另一ACP结合DH执行脱水反应，证实二聚体两腔室可同步进行不同催化步骤。连接肽L5的柔性使ACP活动半径达84?，通过"扭摆"构象实现底物在腔室间定向传递。

这项研究首次阐明迭代型I型PKS的完整工作机制：(1)确立ACP-AT-KS三级相互作用网络；(2)发现KS门控环与DH构象旋转的新型调控模式；(3)证实交联技术可稳定megasynthase动态中间态。该成果不仅为抗结核药物设计提供精确结构模板，更建立了研究超大分子机器的普适性方法学。Ziran Jiang等通过创新性方法突破传统结构生物学限制，相关技术可拓展至其他PKS和脂肪酸合成酶研究，为天然产物工程化改造奠定理论基础。论文发表于《Nature Communications》彰显其方法论创新与转化医学价值的双重意义。