Eps15 EH结构域与Dab2无序区的动态互作网络驱动网格蛋白介导的内吞相分离机制

本研究揭示了Eps15的EH结构域通过识别Dab2320-495无序区中NPF基序及其他苯丙氨酸富集序列，形成动态竞争性互作网络的分子机制。研究人员运用核磁共振技术解析了EH结构域的多价态结合特性，发现Eps15自身IDR（Eps15IDR）与Dab2可同时结合EH123并促进相分离，为理解网格蛋白介导内吞（CME）早期阶段的蛋白质动态募集提供了新见解。

　　

细胞通过网格蛋白介导的内吞作用（Clathrin-mediated endocytosis, CME）精准调控物质运输，这一过程依赖于复杂蛋白质网络的动态组装。其中，Eps15作为最早到达内吞位点的支架蛋白之一，其N端三个EH（Eps15 homology）结构域如何识别不同底物、如何协调自身抑制与功能激活，一直是领域内未解的难题。更引人深思的是，这些相互作用如何促成近年来发现的液-液相分离现象，进而调控内吞起始的时空秩序？

为回答这些问题，由Andromachi Papagiannoula和Ida Marie Vedel领衔的国际团队在《Nature Communications》发表重要成果。研究聚焦Eps15 EH结构域与Disabled homolog 2（Dab2）无序区（Dab2_320-495）的相互作用网络，通过核磁共振（NMR）技术首次揭示了EH结构域结合模式的"混杂性"特征——不仅能识别经典NPF（Asn-Pro-Phe）基序，还能与多种苯丙氨酸富集序列动态结合。这种特性使得Eps15自身IDR（含14个DPF基序但无NPF基序）能够与EH结构域形成自抑制状态，同时允许Dab2_320-495竞争性结合，最终形成可诱导相分离的三元动态网络。

研究采用的关键技术包括：1）多构象核磁共振解析EH结构域与Dab2_320-495的动态结合特征；2）¹⁵N弛豫测量量化结合动力学参数；3）CPMG弛豫色散实验测定微观结合常数；4）荧光标记共聚焦显微镜观测蛋白质液滴形成。

Dab2_320-495是具有轻度螺旋倾向的无序区

通过二级化学位移和构象系综计算，发现Dab2_320-495存在三个瞬时螺旋区域（339-354、454-460和486-490），但NPF基序周围未显示特殊结构倾向。¹⁵N弛豫数据显示，328-360区域（helix_N）具有相对刚性特征。

EH2和EH3是混杂性结合器

15N spin relaxation of Dab2_320-495 upon interaction with the EH domains.'>

化学位移扰动（CSP）和弛豫速率分析表明，EH1选择性结合NPF基序，而EH2/EH3还能识别DYF、WPF、DLF等苯丙氨酸富集序列。这种结合具有动态特征，如V399与EH2结合时出现显著峰展宽，提示中间交换过程。

EH123展现增强的结合混杂性

三结构域串联体EH123保留了各EH域的结合特性，但引起Dab2_320-495链整体刚性增加。结合亲和力（100-400 μM）显著高于单个EH域，提示多价结合协同效应。

Eps15自身IDR与EH123的分子内相互作用

320-495 and Eps15 IDR to EH123.'>

Eps15_IDR通过620-680和700-730两个苯丙氨酸富集区域与EH123结合，尽管缺乏NPF基序。竞争实验显示，Eps15_IDR和Dab2_320-495可同时结合EH123，形成动态平衡网络。

Dab2_320-495被招募至Eps15液滴

320-495 is recruited into Eps15 droplets.'>

荧光显微成像证实，Dab2_320-495可特异性富集于Eps15形成的相分离液滴中，且20倍摩尔过量仍不破坏液滴稳定性，表明弱多价相互作用足以维持共相分离。

这项研究从原子层面揭示了EH结构域通过混杂性识别机制协调分子内自抑制与分子间相互作用的精妙平衡。特别重要的是，发现Eps