植物N-识别蛋白PRT1的结构基础：揭示ZZ域识别II型N-降解子及串联RING域二聚化的分子机制

本研究通过解析拟南芥N-识别蛋白PRT1的ZZ域与II型N-降解子（Tyr/Phe/Trp）的复合物结构，首次揭示了植物特有的疏水口袋双位点识别机制，并发现串联RING1-RING2域通过分子内二聚化激活泛素化功能。该研究为N-降解子通路的结构多样性提供了新见解，发表于《Nature Communications》。

　　

在生命活动中，蛋白质的精准降解对维持细胞稳态至关重要。泛素-蛋白酶体系统（UPS）通过N-降解子通路识别蛋白质N端特定残基（如芳香族疏水残基Tyr/Phe/Trp），进而标记待降解底物。然而，植物中负责识别II型N-降解子的分子机制长期未明。拟南芥PROTEOLYSIS1（PRT1）作为关键N-识别蛋白（N-recognin），虽已知其通过ZZ结构域识别底物，但结构基础及串联RING域的激活机制仍是未解之谜。

为回答这些问题，Woo Seok Yang团队综合运用X射线晶体学（分辨率达1.74?）、等温滴定量热法（ITC）、SEC-SAXS/SEC-MALS多尺度结构分析、FRET泛素释放实验等技术，结合AlphaFold预测和点突变功能验证，系统解析了PRT1的工作机制。研究使用拟南芥BIG BROTHER（BB）蛋白的切割产物Tyr⁶¹-BB作为生理底物，通过LC3B融合技术暴露N端降解信号。

N-降解子识别机制

通过解析PRT1^ZZ与Y/F/W型N-降解肽的复合物结构，发现其具有独特的双疏水位点：位点1（Tyr³¹⁷）和位点2（Ile³³³/Phe³⁵²）。其中Phe³⁵²在结合时发生9.5?构象变化，与N端芳香残基形成疏水网络。第三位Phe⁶³通过"屋顶式"相互作用稳定复合物，ITC显示该设计使结合亲和力达微摩尔级（K_D=2.85-23.3μM）。

ZZ的apo结构及结合位点特征'>

ZZ域的结构创新性

相比p62/SQSTM1的ZZ域（识别I型碱性N-降解子），PRT1^ZZ具有超长Loop3（含HxxxH锌指模体），形成更深的疏水口袋。这种拓扑差异解释了其对II型降解子的特异性选择，突变实验证实Phe³⁵²是决定性残基（F352A突变完全丧失活性）。

串联RING域的分子内二聚化

SEC-SAXS显示全长PRT1呈L型构象，AlphaFold预测RING1-RING2通过Leu^79/82-Leu^246/249形成分子内异源二聚体。SEC-MALS和FRET实验证实，破坏二聚界面（4L/S突变）使泛素化活性降低10倍，证明该结构对E3功能至关重要。

这项研究首次揭示了植物N-识别蛋白通过ZZ域变构机制识别II型降解子的结构基础，并阐明了串联RING域通过分子内二聚化激活的新范式。这些发现不仅拓展了N-降解子通路的认知边界，也为设计调控植物蛋白质稳态的工具提供了理论依据。论文通过多尺度结构-功能分析，为理解E3连接酶的进化多样性树立了新标杆。