METTL16介导U6 snRNA m6A修饰的结构与机制解析：为pre-mRNA精准剪接提供新见解

本研究揭示了METTL16通过其C端KA-1结构域识别U6 snRNA内部茎环（ISL），并协同N端甲基转移酶域（MTD）动态催化m6A修饰的分子机制。冷冻电镜结构显示，SAM结合触发U6 snRNA构象重排，将靶向腺苷（A37）定位于催化中心，阐明了该修饰对含BBH motif的pre-mRNA高效剪接的关键作用，为RNA表观遗传调控提供了结构基础。

　　

在基因表达的精密调控网络中，RNA修饰如同暗藏的密码，其中N⁶-甲基腺苷（m⁶A）是最常见的信使RNA修饰之一。这种由甲基转移酶METTL家族催化的修饰，广泛参与RNA剪接、稳定性和翻译调控。然而，作为家族特殊成员，METTL16独树一帜——它不依赖经典的METTL3/METTL14复合体，而是专门靶向U6小核RNA（snRNA）和MAT2A mRNA等特定RNA底物。更引人入胜的是，U6 snRNA的m⁶A修饰直接决定pre-mRNA剪接效率，尤其对5'剪接位点含BBH motif（B=G/C/U, H=A/C/U）的转录本至关重要。但长期以来，METTL16如何精准识别并修饰结构化U6 snRNA的机制始终成谜。

这项发表于《Nature Communications》的研究，通过冷冻电镜（cryo-EM）和晶体衍射技术，首次捕捉到METTL16与U6 snRNA相互作用的动态全过程。研究团队以裂殖酵母（S. pombe）为模型，发现其METTL16的C端KA-1结构域如同"分子锚"，通过精密的氢键网络特异性识别U6 snRNA内部茎环（ISL）的独特结构。其中富含精氨酸的区域（RRR）与ISL顶端的非经典碱基对（如G59-A63）形成"精氨酸叉"式相互作用，这种结合模式与HIV Tat蛋白识别TAR RNA的机制惊人相似。

当辅因子S-腺苷甲硫氨酸（SAM）结合至METTL16的催化口袋后，研究团队观察到U6 snRNA发生戏剧性构象变化：原本游离的ACAGAGA基序（为甲基化位点A37）向MTD域靠拢，其中A37被NPPF基序中的天冬酰胺（Asn168）和苯丙氨酸（Phe171）夹持定位。然而有趣的是，此时A37与SAM仍相距6?，提示该状态为"前催化构象"。通过对比人类METTL16-MAT2A hairpin复合体结构，研究者提出U6 snRNA需进一步折叠形成"过渡区"和"末端茎"结构，才能将A37推入催化位点完成修饰。这种多步骤机制完美解释了为何缺失KA-1结构域的突变体催化效率骤降98%——它不仅提供初始结合位点，更协调了整个甲基化过程的动态转变。

关键技术方法包括：1）利用体外甲基化实验比较全长METTL16与MTD域活性；2）通过X射线晶体学解析KA-1-U6 ISL复合体结构；3）采用冷冻电镜捕获METTL16-SAM-U6 snRNA不同构象状态；4）构建系列U6 snRNA突变体验证结构元件功能；5）在Δmtl16酵母菌株中进行剪接拯救实验。

KA-1 of METTL16 facilitates U6 snRNA m⁶A modification

实验显示全长METTL16对U6 snRNA的K_m值（0.182μM）显著低于单独MTD域（0.752μM），催化效率（k_cat/K_m）提升50倍，证实KA-1域对甲基化的促进作用。

KA-1 of METTL16 facilitates pre-mRNA splicing

剪接分析发现，Δmtl16酵母中SPAC18B11.09c和ckn1 pre-mRNA出现内含子滞留，仅全长METTL16能恢复剪接，而R339E等KA-1突变体则功能丧失，印证该域在体内的必要性。

Cryo-EM structure of the METTL16-U6 snRNA complex

3.4?冷冻电镜结构显示，无SAM时U6 snRNA呈伸展构象，仅ISL与KA-1结合，ACA*GAGA基序远离催化中心，呈现初始结合状态。

Transition of spU6 sRNA to the productive form

对比MAT2A-hp结构发现，U6 snRNA需形成类似"环-茎-过渡区"三级结构才能高效甲基化，C36G等基序突变使活性丧失，证实结构特异性要求。

这项研究不仅破解了METTL16识别U6 snRNA的结构密码，更揭示了RNA修饰酶与结构化底物协同进化的精妙策略。特别值得注意的是，KA-1结构域也存在于U6 snRNA特异性末端尿苷酰转移酶（TUT1）中，暗示不同RNA加工酶可能通过趋同进化获得相似的RNA锚定模块。该发现为设计靶向METTL16的小分子药物提供了精确蓝图，未来或可通过调控m⁶A修饰治疗剪接异常相关疾病，如脊髓性肌萎缩症等。此外，研究中建立的"构象捕获"策略，为解析其他RNA-蛋白质动态互作体系树立了新范式。