裸子植物特异性CYP90Js介导双黄酮生物合成及微生物生产穗花杉双黄酮的机制研究

本研究针对双黄酮类化合物生物合成机制不明的科学难题，揭示了裸子植物特有的CYP90J亚家族通过催化黄酮C-C键二聚化形成双黄酮骨架的关键作用。研究人员通过多组学分析、分子动力学模拟和QM/MM计算，阐明GbCYP90J6介导的3',8"-联苯选择性偶联机制，并成功构建大肠杆菌工程菌株实现穗花杉双黄酮(amentoflavone)的从头合成(4.75 mg/L)。该发现不仅填补了植物次生代谢领域双黄酮合成酶的认知空白，更为神经退行性疾病治疗药物的生物制造提供了新策略。

　　

在神经退行性疾病患者数量预计205年将达1.39亿的严峻形势下，天然双黄酮类化合物因其独特的多靶点治疗特性成为药物研发热点。其中，穗花杉双黄酮(amentoflavone)作为银杏提取物EGb 761的关键活性成分，能有效抑制Aβ₄₀聚集(IC₅₀ 1-10μM)，但其植物提取效率低下(<0.001%)和化学合成步骤繁琐严重制约临床应用。尽管双黄酮发现已近百年，其生物合成机制尤其是黄酮二聚化酶的身份始终成谜，这成为制约该类化合物规模化生产的核心瓶颈。

为破解这一科学难题，研究团队选择富含3',8"-连接型双黄酮的银杏(Ginkgo biloba)为模型，通过组织特异性代谢分析和转录组测序，锁定在叶片高表达的候选基因。创新性地采用烟草瞬时表达系统和大肠杆菌异源表达体系，首次鉴定出裸子植物特有的细胞色素P450酶GbCYP90J6能高效催化芹菜素(apigenin)形成3',8"-联苯结构的双黄酮骨架，其K_m值低至0.4925μM。系统发育分析揭示CYP90J亚家族从石松类CYP90E进化而来，且与双黄酮的植物分布谱高度吻合。

关键技术包括：基于组织特异性代谢组和转录组筛选候选基因；烟草瞬时表达和大肠杆菌异源表达系统验证酶功能；分子动力学模拟解析底物结合构象；QM/MM计算阐明二聚化反应能垒；以及L-酪氨酸高产菌株的CRISPR-Cas9基因组编辑。

Unprecedented GbCYP90J6 drives the dimerization of biflavonoids

研究发现银杏叶片中双黄酮含量显著高于其他组织，通过FPKM>20的高表达基因筛选，从6个候选CYP中鉴定出GbCYP90J6能特异性催化芹菜素形成穗花杉双黄酮。大肠杆菌表达系统证实其催化活性不依赖植物内源酶系，且对甲基化黄酮无活性，表明二聚化先于甲基化修饰。

Gymnosperm-specific CYP90J subfamily enzymes specially catalyze the intermolecular C-C dimerization of flavonoids

系统发育分析显示CYP90J仅存在于裸子植物，与石松类CYP90E构成进化支系。功能表征发现红豆杉(Taxus chinensis)的ChCYP90J7具有类似活性，而石松Selaginella moellendorffii的SmCYP90E3v1仅显示微弱活性，印证了该亚家族的功能分化。

Ligand conformation controlled by surrounding amino acids determines enzyme dimerization catalytic activity

丙氨酸扫描发现活性口袋中31个关键残基，其中L382F突变使酶活提升2倍。分子动力学显示活性突变体(GbCYP90J6_L382F)中两个芹菜素分子的C3'-C8"距离(3.3?)显著短于失活突变体(5.1?)，π-π堆积作用稳定了头尾反平行构象。

Dimerization mechanism validated by QM/MM calculation

QM/MM计算揭示二聚化通过双自由基耦合路径完成：Cpd I先夺取C4'-OH氢形成自由基R5d(能垒12.5 kcal/mol)，随后Cpd II夺取C7"-OH氢生成R5u，两自由基经4.6 kcal/mol的低能垒耦合形成C3'-C8"键，最终酮式-烯醇式互变异构释放42 kcal/mol能量驱动反应完成。

De novo biosynthesis of amentoflavone in E.coli

通过敲除tyrR/pheA和过表达芳香酸路径基因，构建L-酪氨酸高产菌株(1.89 g/L)。结合黄酮合成模块(pYH57)和二聚化模块(pBIF21)，最终工程菌实现穗花杉双黄酮的从头合成(4.75 mg/L)，产量显著高于植物提取(0.059 mg/g DW)。

该研究首次阐明植物界C-C型双黄酮的生物合成机制，突破性地发现裸子植物特异性CYP90J亚家族具有不同于经典P450的 intermolecular coupling功能。通过解析GbCYP90J6的底物识别与区域选择性控制机制，不仅填补了黄酮二聚化酶的认知空白，更为设计其他联苯型天然产物合成酶提供模板。构建的微生物合成体系突破植物提取瓶颈，为阿尔茨海默病等神经退行性疾病的药物开发奠定基础。研究还提出CYP酶功能进化的新范式——从石松类的原始CYP90E到裸子植物特化的CYP90J，展现出植物次生代谢途径创新的分子基础。