基于高通量蛋白质组学的CRBN新底物全景图谱绘制及分子胶降解剂发现

本研究针对分子胶降解剂(MGDs)发现中缺乏理性设计策略和通量限制的难题，开发了基于数据非依赖性采集质谱(DIA-MS)的高通量蛋白质组学平台。通过筛选100种CRBN配体，研究人员鉴定出包括KDM4B、G3BP2和VCL在内的50个新型CRBN新底物，其中17个不含经典β-发夹降解决定子。研究揭示了苯基戊二酰亚胺(PG)基降解剂的高选择性特征，为靶向"不可成药"蛋白提供了新工具。该成果发表于《Nature Communications》，为CRBN介导的蛋白降解研究开辟了新维度。

　　

在靶向蛋白降解(TPD)领域，分子胶降解剂(MGDs)因其能诱导"不可成药"靶点的降解而备受关注。然而，现有免疫调节药物(IMiDs)如来那度胺和泊马度胺仅能靶向有限数量的蛋白质，且缺乏系统性发现新降解剂的技术平台。更关键的是，传统基于细胞活性的筛选方法容易漏检弱降解剂或非必需蛋白，这严重限制了CRBN(一种E3泛素连接酶复合物的底物识别亚基)新底物全景的探索。

为突破这些限制，Martin Steger等研究者开发了创新的高通量蛋白质组学工作流。该平台整合了无标记定量、泛素组分析和TurboID邻近标记等技术，在Huh-7和NB-4细胞系中筛选了5000个化合物库的代表性样本。研究特别关注了苯基戊二酰亚胺(PG)这一新型CRBN结合骨架，通过结构-降解关系分析发现了具有高度选择性的降解剂。

关键技术包括：(1)基于diaPASEF的高通量质谱平台，单次检测可定量10,200个蛋白；(2)全局泛素组分析捕捉30分钟内的泛素化动态；(3)CRBN过表达细胞系增强弱信号检测；(4)TurboID邻近标记验证三元复合物形成；(5)AlphaScreen技术定量蛋白-蛋白相互作用。样本来源于肝癌Huh-7、急性早幼粒白血病NB-4等10种癌细胞系。

【深度蛋白质组筛选揭示新底物】

通过24小时处理后的蛋白质组分析，研究确认了35个已知CRBN底物中的25个，包括IKZF1/3和ZFP91等经典靶点。6小时验证实验结合NEDD8抑制剂MLN4924处理，证实了17个蛋白的CRL4^CRBN依赖性降解。值得注意的是，泛素组分析发现CSNK1A1-K51和ZFP91-K357等关键泛素化位点，这些"热点"与降解效率显著相关。

【系统性发现新型CRBN底物】

在84个初筛候选物中，通过CRL依赖性和泛素化验证确认了16个新底物，包括组蛋白去甲基化酶KDM4B和肿瘤抑制因子FLCN。特别有趣的是，CAK复合物成员MNAT1和CDK13-CCNK对的降解呈现"旁观者效应"，即复合物中单个成员的招募导致相关蛋白被连带泛素化。

【CRBN过表达增强检测灵敏度】

在HEK293-CRBNoe细胞中，SJ10040处理使新底物检测数量增加3倍。这一策略成功验证了ZBTB21和CSNK1E等弱降解靶点，并发现ZNF324等13个新底物。研究还观察到"非生产性泛素化"现象，即泛素化不一定导致降解，这为优化降解剂提供了新思路。

【结构-降解关系揭示选择性机制】

PG核心降解剂展现出显著的选择性优势：在SUSA细胞测试中，仅1/10的PG化合物影响SALL4，而所有IMiD类化合物均导致其降解。通过类似物优化获得的SJ41813对G3BP2的DC₅₀达2.8μM，且仅伴随USP10的次要降解。

【KDM4B和VCL降解剂的特性】

SJ41564选择性降解KDM4B(DC₅₀=36nM)，双Tudor结构域被鉴定为关键降解决定簇。意外发现的是，对位取代的PG化合物如SJ46479能高效降解VCL(DC₅₀=255nM)，其诱导的20个泛素化位点集中在D1结构域。

这项研究通过创新技术平台极大扩展了CRBN可降解蛋白质组的边界，50个新底物的发现打破了β-发夹降解决定子的传统认知。PG核心降解剂展现的优异选择性为开发更安全的靶向药物提供了新范式。特别值得注意的是，KDM4B和VCL等传统难靶向蛋白的降解剂发现，为癌症等疾病治疗开辟了新途径。研究建立的高通量蛋白质组学方法为系统性发现分子胶降解剂设立了新标准，其揭示的"旁观者降解"和"非生产性泛素化"等现象为理解蛋白降解机制提供了重要见解。这些发现不仅丰富了基础生物学认知，更为开发下一代靶向治疗药物奠定了坚实基础。