基因工程改造乳酸菌Lactococcus cremoris实现纤维素降解：可持续生物转化的突破

为解决乳酸菌无法直接利用纤维素的问题，研究人员通过基因工程在Lactococcus cremoris NZ9000中引入外源纤维素酶基因（Cel5I/Cel9A/Cel5H），评估了不同启动子（PepN/B6/P8/LDH）和表面展示锚定系统（cAcmA/cAM12）的效果。研究发现分泌型Cel9A在无定形纤维素（PASC）上降解效率最高，首次实现乳酸菌以纤维素为主要碳源的生长，为生物质资源化利用提供了新策略。

　　

纤维素作为地球上最丰富的可再生碳源，其高效利用是解决能源危机和环境问题的关键。然而，能够天然降解纤维素的微生物（如梭菌属）往往生长条件苛刻，而工业常用的乳酸菌（LAB）虽能生产高附加值化学品（如乳酸、乙醇），却缺乏纤维素降解能力。传统方法依赖物理化学预处理和酶解，成本高昂且产生抑制物。如何让乳酸菌直接利用纤维素，实现"一锅法"生物转化（Consolidated Bioprocessing, CBP），成为领域内亟待突破的难题。

在这项发表于《Biophysical Reports》的研究中，Petra ?travs团队选择具有细胞二糖代谢能力的Lactococcus cremoris NZ9000为底盘，通过基因工程技术引入三种来源不同的纤维素酶基因：来自Ruminiclostridium cellulolyticum的Cel5I（非连续性内切纤维素酶）、Saccharophagus degradans的Cel5H（高活性内切纤维素酶）和Lachnoclostridium phytofermentans的Cel9A（必需性纤维素酶）。研究采用组成型启动子PepN替代传统诱导型启动子PnisA，并比较了分泌表达与两种非共价表面展示系统（cAcmA/cAM12）的效果。

关键技术包括：1）使用Phusion高保真聚合酶构建表达质粒；2）通过SDS-PAGE和Western blot定量分泌蛋白；3）流式细胞术和共聚焦显微镜验证表面展示效率；4）采用PASC和Avicel作为底物测定纤维素酶活性；5）HPAEC-PAD分析纤维寡糖产物；6）通过细胞总蛋白含量和代谢产物监测8天培养期间的生长情况。

3.1 组成型表达系统的优化

比较四种组成型启动子（LDH/P8/B6/PepN）驱动Cel9A表达时，PepN和B6的蛋白产量与诱导型PnisA相当（约1 mg/L），且CMC水解活性最强。这解决了诱导型系统需要持续添加nisin、成本高且抑制生长的痛点。

3.2 分泌系统的效率差异

去除Flag标签使Cel9A和Cel5I分泌量分别提升2倍和9倍，而Cel5H不受影响。最终无标签Cel9A和Cel5I分泌量达1 mg/L，显著高于Cel5H（0.6 mg/L），可能与蛋白折叠特性有关。

3.3 表面展示系统的选择

流式细胞术（MFI检测）和共聚焦显微镜显示，噬菌体来源的cAM12锚定效率显著高于内源cAcmA，其中Cel5H在细胞表面暴露度最高。这为模仿天然SLH结构域的非共价固定提供了新方案。

3.4 纤维素酶的功能验证

分泌型Cel5H对PASC的降解活性最高（比对照高35倍），而Cel5I对微晶纤维素Avicel活性最优（3倍）。HPAEC-PAD分析发现Cel5I/Cel5H主要释放纤维二糖，而Cel9A产生较多纤维四糖。表面展示酶的活性普遍低于分泌型，可能与空间位阻有关。

3.5 纤维素支持生长的实证

在含1.9 g/L PASC的M17培养基中，分泌Cel9A的菌株生长最快：3天内降解30% PASC，细胞总蛋白和代谢物（乙醇达25 mM）产量最高。值得注意的是，纤维素降解产物使代谢流向从同型乳酸发酵转向混合酸发酵，这与细胞二糖代谢途径相关。

该研究首次证明单一种类纤维素酶即可支持乳酸菌在纤维素基质上生长，打破了领域内"必须构建多酶复合体"的传统认知。分泌型Cel9A的优异表现提示：1）过程性内切纤维素酶可能通过持续解链提升底物可及性；2）纤维四糖的后续代谢或存在未知转运机制。使用组成型表达和质粒稳定性设计（Cel9A质粒可稳定遗传10代）为工业化应用奠定基础。

未来通过引入半纤维素酶或预处理技术，可进一步拓展底物范围。该成果不仅为CBP工艺提供了新工具，也为理解乳酸菌的碳源代谢调控提供了新视角，对生物基化学品生产具有重要启示。