构建高效TREM2激动型双特异性抗体：Pioneer文库与SpyDisplay技术的突破性应用

这篇开创性研究介绍了目前最大规模的人类合成抗体文库Pioneer（约2.2×1011功能成员），结合创新的SpyDisplay噬菌体展示技术，成功开发出针对TIGIT、IL-6RA等靶点的高亲和力抗体。研究证实该平台可直接筛选出与临床后期候选抗体相当的优质抗体，特别是在GPCR（如C5aR和CXCR4）等难靶点取得突破，为抗体药物发现提供了强大工具。

　　

摘要

抗体噬菌体展示技术作为从多样化文库中筛选全人源抗体的生物技术方法，因其速度和灵活性已成为抗体药物发现的重要工具。本研究介绍了Pioneer——迄今为止开发的最大合成人源抗体文库之一，包含约2.2×10¹¹个功能性成员。Pioneer采用基于SpyTag-SpyCatcher蛋白连接技术的SpyDisplay系统，能够快速筛选高亲和力抗体。该文库的抗体设计考虑了良好的生物物理特性和可开发性，并能快速标记或转化为各种形式用于筛选和功能分析。

引言

二十多年来，抗体疗法在解决未满足医疗需求和改善严重疾病治疗方面发挥了关键作用。噬菌体展示作为最早从多样化抗体文库中筛选全人源抗体的生物技术方法，因其精确可控的选择过程而保持重要地位。现代噬菌体展示文库通过不断改进，已经能够直接提供具有优异亲和力、特异性和可开发性的抗体。

文库设计

Pioneer文库的设计目标是创建一个能直接提供高质量治疗候选抗体的人类抗体平台。选择Fab格式因其最接近天然免疫球蛋白结构。文库采用两种重链胚系基因（IGHV1-69和IGHV3-23）和两种轻链胚系基因（IGKV1-39和IGLV3-1），这些胚系在细菌中表达良好且临床相关性高。通过六种互补决定区（CDR）的多样化设计，结合三步β-内酰胺酶选择策略，最终获得功能序列占比达89.4%的高质量文库。

文库验证

下一代测序（NGS）分析显示，Pioneer文库中96.5%的序列具有功能。CDR长度分布与天然人类抗体库相似，但潜在有害氨基酸基序的出现频率更低。随机选取的90个Fab克隆中，91%序列正确，95%可成功表达，平均表达量达10.3 mg/L，证实了文库设计的合理性。

噬菌体展示筛选

针对多种抗原（包括OX40、IL-6、GFP、CTLA-4和TIM-3）的筛选结果显示，平均68%的筛选克隆产生特异性信号，60%的测序克隆具有独特序列。获得的抗体亲和力优异，70%的抗体K_D低于10 nM，24%达到亚纳摩尔水平。特别是抗TIM-3抗体在ELISA、流式细胞术、免疫荧光和免疫印迹等多种检测中均表现良好。

抗TIGIT先导候选抗体

针对免疫检查点TIGIT的筛选获得112个独特序列，分为9个独立表位组。36个最佳抗体中，94%的K_D低于10 nM，58%达到亚纳摩尔水平。在细胞实验中，11个IgG候选物均能有效阻断TIGIT/CD155相互作用，EC₅₀为0.8-9.8 μg/mL，与临床阶段抗体相当。生物物理特性分析显示这些抗体具有高热稳定性（Tm2>72°C）、低疏水性和低自相互作用倾向。

抗IL-6RA先导候选抗体

针对IL-6受体的筛选获得144个独特Fab，97%的K_D低于10 nM。12个最佳IgG在细胞实验中有效抑制IL-6信号传导，IC₅₀与已批准的治疗性抗体相当。这些抗体同样表现出优异的生物物理特性和可开发性参数。

抗GPCR抗体筛选

针对两个G蛋白偶联受体（C5aR和CXCR4）的筛选证明了Pioneer平台处理难靶点的能力。抗C5aR抗体在细胞实验中有效抑制受体激活，而抗CXCR4抗体不仅能结合受体，还在transwell迁移实验和cAMP检测中显示出功能活性。尽管部分抗CXCR4抗体表现出多反应性，但仍成功鉴定出5个优质候选物。

讨论

Pioneer文库与SpyDisplay技术的结合代表了抗体发现技术的重大进步。该平台不仅能快速提供高亲和力抗体，还能确保良好的可开发性，大大缩短了从靶点验证到先导化合物优化的时间。特别是在GPCR等传统难靶点上的成功，为开发针对这些重要靶点的治疗性抗体开辟了新途径。研究结果有力反驳了关于噬菌体展示抗体质量欠佳的偏见，证明精心设计的合成文库能够产生与动物免疫相媲美甚至更优的抗体候选物。