"Pioneer抗体库与SpyDisplay技术：高效筛选高亲和力全人源抗体的创新平台及其在GPCR靶点治疗中的应用"

《mAbs》：What does AlphaFold3 learn about antibody and nanobody docking, and what remains unsolved?

（编辑推荐）本研究报道了迄今最大规模合成人源抗体库Pioneer（2.2×1011功能成员）的开发，结合SpyTag-SpyCatcher蛋白连接技术（SpyDisplay），可快速筛选具有优异亲和力（24%抗体KD<1 nM）和成药性的治疗候选分子，成功应用于TIGIT、IL-6RA及难靶点GPCR（CXCR4/C5aR）抗体的开发。

　　

ABSTRACT

抗体噬菌体展示技术作为从多样性库中筛选全人源抗体的生物技术方法，因其速度与灵活性已成为抗体药物发现的核心工具。研究团队构建了迄今最大合成人源抗体库Pioneer（含2.2×10¹¹功能性成员），采用基于SpyTag-SpyCatcher蛋白连接技术的SpyDisplay系统，可快速筛选高亲和力抗体。该库抗体具有优化的生物物理特性和成药性，并能通过模块化组装快速转化为多种筛选格式。针对TIGIT、IL-6RA、C5aR和CXCR4等靶点（含两个挑战性GPCR），直接从库中筛选出参数媲美临床后期候选分子的抗体，证实了该平台在快速抗体发现中的强大效能。

Introduction

抗体药物在疾病治疗中持续发挥关键作用，而噬菌体展示技术通过精确控制筛选条件（如pH依赖性结合或小分子辅助识别），成为获取全人源抗体的重要手段。尽管存在细菌表达限制（如需使用单链抗体片段scFv或Fab），现代噬菌体展示库通过去除互补决定区（CDR）序列风险位点、优化热稳定性等设计，已能直接产出优质抗体。Pioneer库的创新性体现在：采用两种重链（IGHV1-69/IGHV3-23）和两种轻链（IGKV1-39/IGLV3-1）胚系基因，通过四步克隆策略（含两次β-内酰胺酶筛选）确保90%功能序列，并利用三核苷酸合成实现CDR3天然多样性。

Results

Library design

Pioneer库设计聚焦三个核心：

1. 1.

   胚系选择：基于近600个临床抗体分析，选用细菌表达优良且临床验证的胚系，重链去除C_H1区二硫键半胱氨酸以提升Fab产量；

2. 2.

   多样性生成：所有CDR区均采用胚系特异性设计，CDR1/2通过阵列合成控制风险基序（如去除非预期糖基化位点），CDR3通过三核苷酸合成保留天然分布；

3. 3.

   质量控制：NGS验证显示96.5%序列功能性，CDR3长度分布（重链6-22aa，轻链8/10aa）与天然抗体谱系一致，且PTM风险基序频率低于天然抗体。

Phage display selections

测试筛选针对6类抗原（含GPCR靶点）显示：

• •

  平均68% ELISA阳性率，60%序列独特性

• •

  抗TIM-3抗体在流式、免疫荧光等多平台验证中全部有效

• •

  抗TIGIT抗体鉴定出9个独立表位箱，58%抗体K_D<1 nM，其中AbD54577在细胞活性（EC₅₀ 0.8 μg/mL）和热稳定性（Tm2>72°C）上超越临床对照抗体

Therapeutic lead generation

1. 1.

   抗TIGIT抗体：55个独特Fab中，94% K_D<10 nM，11个转化为IgG后均显示：

   • •

     优异单分散性（SEC纯度>95%）

   • •

     低自相互作用（SI-BLI信号<0.3 nm）

   • •

     加速稳定性（4周37°C无降解）

2. 2.

   抗IL-6RA抗体：144个Fab中97% K_D<10 nM，12个IgG在iLite检测中抑制效能与已上市药物sarilumab相当。

3. 3.

   GPCR靶点突破：

   • •

     抗C5aR抗体通过全细胞筛选获得，AbD61531抑制C5a信号（IC₅₀ 0.4 nM）优于临床候选izastobart；

   • •

     抗CXCR4抗体采用Salipro纳米颗粒筛选，5个IgG在迁移实验和cAMP检测中效价等同临床阶段抗体ulocuplumab。

Discussion

Pioneer库通过三大创新解决行业痛点：

1. 1.

   规模效应：2.2×10¹¹库容结合SpyDisplay技术，实现无需体外成熟的直接高亲和力筛选；

2. 2.

   智能化设计：CDR区理性优化使PTM风险低于天然抗体，同时保留结构多样性；

3. 3.

   多功能接口：内置SpyTag支持模块化组装（如BiCatcher-HRP偶联）和双特异性抗体构建。该平台在10周内即可完成从筛选到候选分子确定的全程，为GPCR等难成药靶点提供了新解决方案。