百里香和牛至精油对蜡样芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌基因表达动态的调控机制研究

本研究通过实时定量RT-PCR技术，揭示了百里香（Thymus vulgaris）和牛至（Origanum vulgare subsp. hirtum）精油（EOs）亚抑制浓度（0.29-0.58 mg/mL）对食品源蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和枯草芽孢杆菌（B. subtilis）关键基因（如spo0A、pbpF、plcR）的时序调控作用，为天然防腐剂靶向抑制芽孢杆菌的毒力（virulence）和群体感应（quorum sensing）机制提供分子依据。

　　

1 引言

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和枯草芽孢杆菌（B. subtilis）是革兰氏阳性、产孢的食源性病原体，常见于淀粉类食品中。前者可引发呕吐型（cereulide毒素）和腹泻型（enterotoxin）食源性疾病，后者虽具益生特性但可能导致食品黏液化变质。传统防腐剂的替代需求催生了百里香（胸腺酚型）和牛至（香芹酚型）精油（EOs）的应用研究，其酚类成分（如thymol、carvacrol）通过破坏膜完整性、干扰群体感应（quorum sensing）和毒力基因表达发挥抑菌作用。

2 材料与方法

2.1 菌株与培养

实验选用从无防腐剂马铃薯团分离的产毒B. cereus 11（含cesC基因）和含乳酸防腐剂团分离的B. subtilis 58C，经BHI培养基37°C培养后标准化至5×10⁵ CFU/mL。

2.2 精油处理

将EOs（36 mg/mL初始浓度）用PBS-Tween 80乳化后，通过微量稀释法测试亚抑制浓度（1/4 MIC和1/2 MIC），时间梯度为6-48小时。

2.3 基因表达分析

基于参考基因组（CP020383、CP34551）设计特异性引物，通过SYBR Green实时RT-PCR检测毒力基因（plcR、nheB）、孢子形成基因（spo0A）、膜修复基因（pbpF）等表达，以16S rrn为内参，采用2^-ΔΔCt法计算相对表达量。

3 结果

3.1 基因表达动态

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  早期响应（6小时）：多数基因下调，仅B. cereus的spo0A和B. subtilis的sigB/pbpF显著上调，提示细胞应激启动延迟。

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  毒力基因激活：B. cereus的plcR（24小时达180倍）和nheB（18小时峰值）在百里香EO处理下剧烈响应，表明毒力通路是其主要防御机制。

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  膜修复主导：B. subtilis的pbpF在百里香EO处理12小时表达量暴增205倍，凸显其对膜损伤修复的依赖。

3.2 浓度与成分差异

0.58 mg/mL浓度通常诱导更强基因表达，但牛至EO在0.29 mg/mL对pbpF的刺激更显著。百里香EO更早触发spo0A（6小时），而牛至EO持续激活sigB至24小时，反映酚类组成差异（thymol vs. carvacrol）的调控特异性。

4 讨论

4.1 物种特异性机制

B. cereus依赖毒力基因（plcR/nheB）抵抗EOs，而B. subtilis优先激活膜相关基因（pbpF）和孢子调控基因（spo0A）。spo0A在百里香EO处理18-24小时的表达沉默现象，首次提示特定酚类可能阻断其转录。

4.2 应用启示

亚抑制浓度EOs通过延长滞后期和干扰群体感应抑制细菌增殖，但需警惕毒力基因的反弹表达。百里香EO对spo0A的阶段性抑制可能为新型抗孢子策略提供线索。

5 结论

本研究阐明两种精油通过差异调控基因网络抑制芽孢杆菌的分子路径，为开发靶向天然防腐剂奠定基础。未来需解析EOs组分互作（如γ-terpinene与p-cymene）对基因调控的影响，以优化食品保鲜应用。