大肠杆菌蛋白uL29与ACP协同稳定Tn7转座子编码蛋白TnsD及其DNA结合活性的分子机制研究

本研究揭示了宿主因子uL29和ACP通过静电相互作用稳定Tn7转座子靶向蛋白TnsD的分子机制。研究人员通过生物化学与结构预测方法，发现这两种蛋白协同作用于TnsD的C端结构域，显著增强其与attTn7位点的结合能力，解决了长期以来TnsD蛋白稳定性差的技术瓶颈。该成果为理解Tn7转座子的精准靶向机制提供了新见解，对开发基于转座子的基因编辑工具具有重要意义。

　　

在基因组编辑技术蓬勃发展的今天，转座子作为自然界天然的基因搬运工，其精妙的靶向机制一直吸引着科学家们的目光。Tn7转座子家族以其独特的双靶向系统著称——既能精准插入宿主基因组的安全位点attTn7，又能靶向接合质粒的复制结构，堪称微生物界的"智能基因快递员"。然而多年来，其核心靶向蛋白TnsD的"暴脾气"（极易聚集的特性）阻碍了科学家们揭开其分子机制的神秘面纱。

这项发表在《Mobile DNA》的研究犹如一场及时雨，来自加拿大麦克马斯特大学的Shani B. Leyva Camacho团队发现，大肠杆菌中的两个"保姆蛋白"——核糖体蛋白uL29和酰基载体蛋白(ACP)，能够巧妙安抚TnsD的暴躁性格。通过精密的静电相互作用，这对宿主因子搭档如同分子稳定器，牢牢抓住TnsD的C端区域，不仅防止其"闹脾气"（聚集），还显著提升了其识别attTn7位点的能力。这一发现为理解转座子的精准靶向机制提供了关键拼图，更为改造转座子工具开辟了新思路。

研究人员运用了多项关键技术：通过电泳迁移率变动实验(EMSA)定量分析DNA结合活性；利用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)解析蛋白质相互作用；采用AlphaFold2/3进行复合物结构预测；结合位点特异性突变验证关键相互作用界面；通过质谱技术区分ACP的apo（无辅基）和holo（含4'-PP辅基）形态。

C-terminal domain of TnsD confers binding specificity to the attTn7 site

研究发现全长TnsD虽能特异性识别attTn7位点，但纯化过程中表现出严重聚集倾向。通过尿素提取获得的可溶性蛋白显示，其C端结构域（389-508位氨基酸）是DNA结合特异性的决定因素，而N端结构域仅介导非特异性DNA结合。

ACP and uL29 act cooperatively to influence DNA binding by TnsD

电泳实验揭示apo-ACP和holo-ACP均能与uL29协同作用，形成迁移速率更慢的TnsD:attTn7复合物。值得注意的是，这种稳定效应严格依赖于两种宿主因子的同时存在，且ACP的磷酸泛酰巯基乙胺修饰(4'-PP)并非必需条件。

uL29 and ACP stabilize TnsD through direct protein-protein interactions

Native PAGE显示uL29（pI=9.98）和TnsD因带正电难以进入凝胶，但加入ACP（pI=4.1）后形成新型复合物。浓度实验证实，宿主因子能将TnsD的溶解度提高3倍以上，且该作用主要通过C端结构域实现。

The "recognition helix" of ACP mediates the interaction with uL29 and TnsD

结构预测指出ACP的α2螺旋（30-60位氨基酸）富含14个酸性残基，与TnsD的碱性表面（Arg397/401/405等）形成电荷互补。实验证实，破坏该界面的ACPD39R/E42A突变体完全丧失稳定功能。

uL29 anchors ACP to TnsD

通过设计uL29R47A/R48S/K54A等系列突变体，发现uL29通过Arg47/Lys54等残基同时桥接TnsD和ACP，其与TnsD的界面面积（893?²）远大于ACP界面（337?²），扮演着分子锚定的核心角色。

这项研究首次阐明了宿主因子稳定Tn7靶向复合物的分子机制：uL29如同"分子锚"提供主要结合能，ACP则像"分子胶水"加固相互作用，二者协同维持TnsD的功能构象。该发现不仅解释了早期观察到的转座频率变化现象，更为重要的是，为工程化改造转座系统提供了新靶点——通过理性设计宿主因子结合界面，可能开发出更稳定的基因插入工具。与近期发现的V-K型CRISPR相关转座子中uS15蛋白的作用相比，本研究揭示了一种不依赖核酸的稳定机制，拓展了我们对转座子-宿主协同进化策略的认知。未来研究若能获得复合物的高分辨率结构，将有望实现Tn7转座系统的精准调控设计。