综述：寡核苷酸非对映异构体表征的新兴趋势

这篇综述系统评述了2023-2025年间寡核苷酸非对映异构体（PS修饰）分析技术的最新进展，重点探讨了离子淌度质谱（IM-MS）和亲水相互作用色谱（HILIC）等创新方法在解决硫代磷酸酯（PS）立体构型（Sp/Rp）鉴定难题中的应用，并指出当前单方法最多仅能分离32种异构体的技术瓶颈。

　　

液体色谱技术

近年来液相色谱在寡核苷酸非对映异构体分离中持续占据主导地位。传统离子对反相色谱（IPRP）和阴离子交换色谱（AEC）仍广泛使用，而新兴的亲水相互作用色谱（HILIC）展现出独特优势——特别是对含5个以下PS键的siRNA（如Nedosiran反义链32种异构体）的分离。研究发现色谱柱表面化学性质与PS键微环境相互作用是分离关键，但完全分离≥2¹⁷种异构体（如Nusinersen）仍不现实。

非色谱技术突破

离子淌度质谱（IM-MS）通过碰撞截面差异成功区分了含3个PS键的ASO异构体，其分辨率较传统方法提升30%。核磁共振（NMR）则通过³¹P化学位移差异实现Sp/Rp构型鉴定，但灵敏度限制其定量应用。毛细管凝胶电泳（CGE）在区分长度＞100nt的gRNA异构体时表现出独特优势。

正交分离策略

针对FDA强调的"原料药一致性"要求，组合使用IPRP-IM-MS多维分析可提高异构体指纹图谱可靠性。酶解预处理将gRNA分解为含1-2个PS键的片段后，HILIC-MS检测限可达0.1%，显著优于完整分子分析。

未来挑战与机遇

立体纯PS修饰寡核苷酸虽能减少异构体数量，但可能引入新的分析难题（如PS₂氧化杂质）。目前最大分离能力仍停留在32种异构体，亟需开发超高分辨率分离介质和人工智能辅助构型预测算法。EMA最新指南明确要求采用正交方法评估批次间异构体组成差异，这将成为质量控制的新标准。