牛凝乳酶在Komagataella phaffii中不同组成型表达系统的比较研究及其在食品工业中的应用

本研究针对传统甲醇诱导型启动子PAOX1在牛凝乳酶（chymosin）生产中存在的毒性风险与工艺复杂性，首次系统比较了Komagataella phaffii中三种组成型糖酵解启动子（PPGK、PGAP和PTEF）的表达效率。研究发现PTEF在28°C培养条件下可实现807.76 IMCU/mg的高活性酶产量，且单步纯化后酶学特性与商业产品相当。该成果为食品工业提供了更安全高效的重组酶生产方案，发表于《Journal of Dairy Science》。

　　

在奶酪生产中，牛凝乳酶（chymosin）作为关键凝固剂，其特异性切割κ-酪蛋白的能力直接影响产品得率和品质。目前全球80%的奶酪依赖微生物重组技术生产，但主流生产系统如Aspergillus niger和Kluyveromyces lactis仍存在工艺缺陷。更值得关注的是，甲基营养型酵母Komagataella phaffii（原Pichia pastoris）虽具备高密度培养和真核翻译后修饰优势，但其常规使用的甲醇诱导型启动子P_AOX1存在明显短板——甲醇不仅具有毒性和易燃性，还会引发细胞氧化应激，导致重组蛋白产量受限。Noseda等学者此前报道的P_AOX1系统在生物反应器中仅获得1,215 IMCU/g的产量，远未达到工业化需求。

为突破这一技术瓶颈，Roberta F. Barros团队创新性地采用组成型表达策略，系统比较了三种糖酵解途径相关启动子的性能。研究通过合成密码子优化的牛前凝乳酶原B基因（CHYMB），构建了分别含有P_PGK（3-磷酸甘油酸激酶启动子）、P_GAP（甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子）和P_TEF（翻译延伸因子启动子）的重组载体，并利用电穿孔法转化K. phaffii X-33菌株。关键技术包括：基于MD牛奶琼脂的活性克隆筛选、REMCAT法测定国际凝乳单位（IMCU）、分子排阻色谱纯化、PNGase F糖基化分析以及实时定量PCR检测基因拷贝数。

Strain Construction and Selection of Transformants

研究发现，30°C培养时仅P_PGK转化子（_YKPC17）显示胞外活性，而P_GAP和P_TEF系统需将温度降至25-28°C才解除代谢抑制。这提示强启动子引发的内质网应激（UPR）可能通过错误折叠蛋白积累和活性氧（ROS）过量产生抑制细胞生长。

Purification and Characterization

单步纯化获得4,871 IMCU总活性，比活达807.76 IMCU/mg，显著优于Filkin等报道的P_AOX1系统（220 IMCU/mg）。SDS-PAGE显示40 kDa糖基化条带，经PNGase F处理后证实为N-连接糖型，这与van den Brink报道的糖基化增强稳定性的结论一致。底物特异性实验证实重组酶仅切割κ-酪蛋白，50°C处理20分钟后仍保留65%活性，符合工业应用标准。

Effect of Growth Temperature

28°C培养时P_TEF系统（_YKTC31）展现最佳性能，48小时产量达160.5 IMCU/mL，单位生物量产率7,000 IMCU/g。值得注意的是，qPCR显示P_GAP系统（_YKGC6）虽含3个基因拷贝，但产量反低于单拷贝的_YKTC31，印证了Mellitzer提出的"基因剂量-产量非线性关系"理论。

这项研究首次证实组成型表达系统可突破P_AOX1的产量瓶颈，其中P_TEF在28°C的培养方案兼具安全性与经济性。该成果不仅为乳制品工业提供了更优的酶生产平台，其揭示的温度-启动子协同调控机制也为其他重组蛋白生产提供了重要参考。未来研究可进一步优化生物反应器参数，并探索糖基化修饰对酶热稳定性的分子机制。