基于正交阵列设计优化牛乳清蛋白和酪蛋白深度水解工艺以降低致敏性研究

为解决婴幼儿牛乳(BM)过敏问题，研究人员通过正交阵列设计优化了乳清蛋白(DH-WP)和酪蛋白(DH-CN)的深度水解工艺，采用风味蛋白酶(55°C, pH 6.5)和中性蛋白酶(50°C, pH 7)分别获得肽段<3 kDa占比99.20%和98.34%的水解产物。通过RBL-2H3细胞模型和质谱分析证实其致敏性显著降低，为低敏婴儿配方奶粉开发提供理论支持。

　　

牛乳(BM)作为营养丰富的天然食品，却因含有乳清蛋白和酪蛋白等主要过敏原，导致全球3%-8%的婴幼儿出现过敏反应。传统回避疗法易引发营养失衡，而热处理、发酵等方法对致敏性降低有限。酶解法因其高效、温和的特点成为研究热点，但现有工艺参数缺乏系统优化，且肽段分子量分布(MWD)与致敏性的直接关联尚未明确。为此，江南大学Maozhong Sun团队在《Journal of Dairy Science》发表研究，通过创新性实验设计解决了这一难题。

研究采用单因素实验结合L₉(3⁴)正交阵列设计，以风味蛋白酶和中性蛋白酶分别水解乳清蛋白与酪蛋白，通过高效凝胶过滤色谱分析MWD，并运用RBL-2H3细胞模型评估致敏性。样本来源于新西兰恒天然集团的原料，关键实验技术包含Tricine-SDS-PAGE电泳、间接竞争ELISA(ic-ELISA)及UPLC-MS/MS肽段鉴定。

选择蛋白酶

比较6种蛋白酶水解效率发现，风味蛋白酶处理5小时后乳清蛋白<3 kDa肽段占比超96%，中性蛋白酶对酪蛋白水解效果最佳，最终选定这两种酶进行后续实验。

单因素优化

温度实验中，55°C时乳清蛋白水解产物小肽含量达峰值99.43%，而酪蛋白在50°C时达98.75%。pH值影响显示，乳清蛋白在pH 6.5时效果最优，酪蛋白则在pH 7.0-7.5区间稳定。酶底物比(E/S)超过8,000 U/g后水解效率趋于平稳。

正交实验验证

确定乳清蛋白最佳条件为55°C、pH 6.5、E/S 10,000 U/g、5小时，酪蛋白为50°C、pH 7.0、E/S 10,000 U/g、4小时。验证实验测得DH-WP和DH-CN的<3 kDa肽段分别达99.20%和98.34%，水解度分别为26.6%和23.1%。

致敏性评估

FAA分析显示DH-WP中疏水性氨基酸增加9.26-60.35倍。Tricine-SDS-PAGE证实主要过敏原蛋白条带完全消失。ic-ELISA检测显示DH-WP和DH-CN残留抗原性仅为原蛋白的12.14%和7.18%。RBL-2H3细胞实验中，组胺释放量降低63.42%(DH-WP)和58.16%(DH-CN)，IL-4分泌下降而IFN-γ上升，细胞内Ca²⁺荧光强度显著减弱。

线性表位分析

UPLC-MS/MS鉴定显示，DH-WP中β-乳球蛋白(β-LG)线性表位清除率达90.91%，α-乳白蛋白(α-LA)未检出残留肽段；DH-CN中α_S2-CN和κ-CN表位完全清除，α_S1-CN和β-CN清除率分别为83.33%和97.37%。

该研究通过多维度验证表明，深度水解工艺能有效破坏牛乳过敏原的线性表位，显著降低致敏性。创新性地将正交设计与生物活性评价相结合，为低敏婴儿配方奶粉开发提供了标准化工艺参数和科学评价体系。未来需进一步开展动物实验验证长期安全性，但现有成果已为功能性乳蛋白开发奠定了重要基础。