TSG6通过调控缺氧微环境影响犬乳腺肿瘤细胞耐药性与血管生成的3D球体模型研究

本研究针对犬乳腺肿瘤(Tumor necrosis factor stimulated gene-6, TSG6)在肿瘤微环境(TME)中的调控机制，通过建立TSG6敲低的3D球体模型，揭示了TSG6通过影响缺氧诱导因子HIF-1α表达，显著降低多药耐药基因(MRP1/P-gp)表达和血管生成标志物CD31水平，为犬乳腺肿瘤治疗提供新靶点。

　　

在肿瘤治疗领域，缺氧微环境如同一个"黑暗森林"，滋养着肿瘤细胞的耐药性和转移能力。犬乳腺肿瘤(MGT)作为宠物临床常见恶性肿瘤，其治疗困境与人类乳腺癌高度相似——肿瘤内部缺氧区域会激活HIF-1α信号通路，进而促进血管新生和化疗抵抗。韩国首尔国立大学Ga-Hyun Lim团队在《Scientific Reports》发表的研究，首次将目光聚焦于炎症相关蛋白TSG6(TNF-α stimulated gene-6)，通过创新的3D球体模型，揭开了该分子调控肿瘤微环境的新机制。

研究人员采用siRNA转染技术建立TSG6敲低的犬MGT细胞系(CIPp和CIPm)，结合超低吸附培养板构建3D球体模型。通过ELISA、Western blot验证敲除效率后，利用缺氧探针pimonidazole检测球体内部缺氧状态，并采用血管共培养模型评估内皮细胞(ECs)的管腔形成能力。关键实验还包括多柔比星(DOX)耐药性测试和qPCR检测多药耐药基因表达。

TSG6影响肿瘤生长因子和多药耐药基因表达

TSG6敲除使犬MGT细胞中TGF-β和VEGF表达量显著下降，多药耐药相关蛋白MRP1和P-gp的mRNA水平降低约50%（图2）。Western blot证实3D球体中TSG6蛋白表达成功下调（图3F,G）。

TSG6敲除球体模型的建立与验证

添加Matrigel的改良培养方案解决了传统球体核心坏死问题（补充图1）。免疫组化显示TSG6敲除球体中目标蛋白表达显著降低（图3C,E），为后续研究奠定基础。

缺氧状态改善与耐药性逆转

pimonidazole染色显示TSG6敲除使球体缺氧区域减少60%（图4B）。当用2.3-9.2μM DOX处理时，敲除组细胞存活率显著降低，凋亡标志物caspase 3/7荧光强度增加3倍（图5），证实TSG6通过调控缺氧微环境影响化疗敏感性。

血管生成能力显著抑制

在1:3比例共培养的血管化球体中，TSG6敲除使内皮细胞标志物CD31⁺区域减少70%（图6E）。条件培养基实验进一步显示，敲除组EC管腔形成的关键参数（连接点数、分支长度等）下降50%以上（图7），表明TSG6通过旁分泌作用调控肿瘤血管化。

这项研究首次证实TSG6是犬MGT微环境调控的核心枢纽：通过上调HIF-1α创造缺氧生态，进而激活MRP1/P-gp介导的化疗抵抗和VEGF驱动的血管新生。创新性的3D球体模型不仅克服了传统2D培养的局限性，更模拟了体内肿瘤的立体结构特征。特别值得注意的是，TSG6对CD31⁺血管网络的抑制作用，为抗血管生成疗法提供了新思路。该发现不仅对宠物临床有直接指导价值，其机制研究也为人类三阴性乳腺癌治疗提供了跨物种参考。未来研究可进一步探索TSG6抑制剂与常规化疗的联用方案，或开发针对该通路的靶向递药系统。