大肠杆菌中利福平诱导的rRNA丢失实为提取假象：揭示RNA稳定性研究中的方法学陷阱

本研究针对利福平处理导致大肠杆菌rRNA降解的争议性发现，通过系统比较四种RNA提取方案，证实先前报道的16S/23S rRNA降解实为温和裂解方法造成的提取假象。研究人员采用热裂解和机械裂解等强力方法，证明在指数生长期细胞中rRNA实际保持稳定，不会与mRNA竞争RNase E降解途径。该发现为RNA稳定性研究提供了关键方法学参考，解决了领域内长期存在的技术争议。

　　

在分子微生物学研究领域，RNA稳定性测量是理解基因表达调控的基础。当科学家们试图通过抗生素利福平（rifampicin）抑制转录来研究RNA降解时，一个令人困惑的现象出现了——原本被认为极其稳定的核糖体RNA（rRNA）竟然显示出与mRNA相似的降解速率。这个由Hamouche等人报道的反常现象引发了系列重要问题：如果占细胞RNA总量80%以上的rRNA确实在降解，它们是否会与mRNA竞争有限的RNase E降解酶？这是否会重塑我们对细菌RNA代谢的整体认识？

为解开这个谜团，Mathilde Burck等研究者设计了一系列精妙的对比实验。他们敏锐地注意到，不同实验室报告的rRNA稳定性数据存在显著差异，而这些差异很可能源于RNA提取方法的区别。通过系统比较四种常用提取方案，研究团队发现温和的Trizol裂解法确实会导致rRNA表观丢失，而强力裂解方法则能保持rRNA稳定。这一发现不仅解释了先前矛盾的实验结果，更重要的是揭示了RNA研究领域潜在的方法学陷阱。

该研究发表在《Scientific Reports》上，主要采用了四种RNA提取方案对比：Trizol温和震荡裂解（Protocol A）、Trizol相分离（Protocol B）、热裂解RNA snap法（Protocol C）和机械裂解柱纯化法（Protocol D）。通过琼脂糖凝胶电泳定量分析rRNA含量，结合RT-qPCR测定多种mRNA半衰期，研究人员系统评估了不同方法对RNA稳定性测量的影响。

【结果与讨论】

【Effects of RNA extraction protocols on yields and proportions of RNA】

比较四种提取方案发现，温和裂解的Protocol A和B总RNA得率仅5-6 μg/mL/UOD_600nm，且小RNA（tRNA和5S rRNA）占比异常高（达70%）；而强力裂解的Protocol C和D得率提高4-13倍，正确反映了细胞内rRNA占主导（23S+16S rRNA占97%）的实际比例。关键发现是：仅温和裂解方案会显示总RNA在利福平处理后下降35-40%。

【Effects of RNA extraction protocols on rRNA concentrations over time】

时间进程实验显示，Protocol A和B中23S/16S rRNA在1小时内减少74-90%，而Protocol C和D中保持稳定。5S rRNA在所有方案中均保持稳定，证实降解假象特异于大分子量rRNA。

【The cell lysis method: a decisive factor in the loss of 23S and 16S rRNAs】

通过改良方案验证，将Protocol A的温和震荡改为FastPrep机械破碎（A.v1）后，rRNA不再丢失；反之将Protocol C的热裂解改为温和震荡（C.v1）则重现rRNA丢失现象。证明裂解强度是决定因素，与具体试剂无关。

【Possible causes of 16S and 23S rRNA loss after rifampicin treatment under gentle cell disruption】

系列追踪实验排除了rRNA通过柱流失（Test 1）、被细胞碎片捕获（Test 2）或被DNA/蛋白复合物束缚（Tests 5-6）的可能性。Test 3发现柱二次洗脱可回收部分核酸复合物，但不足以解释全部rRNA丢失。

【Effect of RNA extraction protocols on the levels of other RNAs after rifampicin treatment】

tRNA在所有方案中均保持稳定。mRNA半衰期测定显示，强力裂解可获得稳定数据（如maeA mRNA半衰期约4.0分钟），而温和裂解导致部分mRNA（如ihfB）降解曲线不可靠（R²<0.5）。

研究最终证实，利福平处理后的rRNA降解现象是温和裂解方法造成的方法学假象。在指数生长期的大肠杆菌中，23S和16S rRNA实际保持稳定，不会竞争RNase E降解途径。这一结论解决了领域内的重要争议，强调强力裂解对RNA稳定性研究的关键作用。值得注意的是，该结论仅适用于指数生长条件，在营养压力等特殊生理状态下rRNA降解的可能性仍需进一步探索。这项研究为细菌RNA代谢研究提供了方法学基准，对准确理解RNA降解调控网络具有重要意义。