化学修饰tRNA增强同源密码子富集mRNA的翻译能力——突破mRNA疫苗稳定性和表达效率瓶颈的新策略

本研究针对mRNA疫苗存在的稳定性差和翻译效率低等关键问题，创新性地提出"tRNA-plus"策略。研究人员通过系统分析SARS-CoV-2 Spike mRNA的密码子使用偏好性和稳定性，筛选出关键tRNA，并开发了在反密码子环和TΨC环多位点化学修饰的tRNA变体。实验证明该策略可使Spike蛋白表达提升4.7倍，同时降低免疫原性。通过LNP共递送mRNA-tRNA疫苗，在体内显著增强了体液和细胞免疫应答。该研究为提升mRNA治疗产品的效力提供了普适性解决方案。

　　

在COVID-19大流行中，mRNA疫苗展现了其设计灵活、生产快速的优势，但稳定性差和翻译效率低等问题限制了其广泛应用。传统解决方案如5'端帽(Cap)结构优化、密码子优化和环状RNA(circRNA)设计等，往往面临合成工艺复杂、产量受限等挑战。与此同时，科学家们逐渐认识到tRNA(转运RNA)作为遗传密码的关键解码器，其丰度和修饰状态会通过"密码子最优性(codon optimality)"机制影响mRNA稳定性和翻译效率——当核糖体遇到非最优密码子时，会因同源tRNA不足而暂停，导致mRNA被降解。这一发现为Liangzhen Dong和Qing Xia团队开展突破性研究提供了理论基础。

研究人员假设：通过人工调控tRNA可用性可以增强同源密码子富集mRNA的翻译能力，这一策略被命名为"tRNA-plus"。为验证这一设想，团队首先系统分析了SARS-CoV-2 Spike(B.1.1.529)mRNA的密码子使用特征，发现10个密码子(如TTC、CTG等)的使用频率比宿主细胞高1.67-2.65倍。通过建立基于密码子频率和稳定性系数(CSC)的评分系统，筛选出856个最优密码子和414个非最优密码子，并据此选择了20种潜在功能tRNA进行验证。

关键技术方法包括：建立密码子贡献评分系统筛选关键tRNA；开发多位点化学修饰tRNA合成技术(重点关注反密码子环和TΨC环修饰)；构建稳定表达报告基因的HEK293T细胞系评估tRNA功能；采用核糖体分析(ribosome profiling)和RNA测序技术监测翻译动态；开发LNP共递送mRNA-tRNA的疫苗配方；通过ELISA、ELISpot和流式细胞术等全面评估免疫应答。

研究结果部分显示：

1. 1.

   tRNA过表达显著增强Spike蛋白表达

   实验证实过表达筛选的tRNA可使Spike蛋白水平提升达4.7倍。特别值得注意的是，将tRNA^AlaAGC-2-1的反密码子改为GGC(wobble配对)后，其促进表达的效果优于原始序列，证实Watson-Crick配对比wobble配对具有更高翻译效率。当与密码子优化联用时，两者表现出协同效应，使蛋白表达上限进一步提高。

2. 2.

   tRNA-plus增强mRNA稳定性和翻译效率

   通过α-鹅膏蕈碱介导的mRNA衰减实验和Tet-off系统证实，tRNA过表达可延长Spike mRNA半衰期。核糖体分析显示tRNA过表达细胞中核糖体在Spike mRNA上的占据密度显著增加，且起始密码子附近的核糖体拥堵现象减轻，表明翻译延伸速率提升促进了更多核糖体进入延伸阶段。

3. 3.

   化学修饰tRNA展现高效解码能力

   团队设计了一系列在D环(Gm18)、反密码子环(m⁵C34、Cm34、m¹G37)和TΨC环(Ψ55、m¹A58)等关键位点修饰的tRNA变体。其中Cm34修饰的tRNA表现出最强的通读活性，与m¹G37联用时效果更佳，后者可稳定tRNA-核糖体相互作用。氨基酸酰化实验显示m¹G37还能补偿Cm34导致的氨酰化效率下降。

4. 4.

   修饰降低tRNA免疫原性

   在HEK293T-TLR8报告系统和THP-1来源的M0巨噬细胞模型中评估显示，Gm18、m¹G37、Ψ55等单一位点修饰即可降低tRNA的TLR7/8激活能力。多重修饰的tRNA变体(如Lt-12和Lt-13)免疫毒性进一步降低，可能与Gm18-Ψ55相互作用增强tRNA结构刚性有关。

5. 5.

   mRNA-tRNA疫苗增强免疫应答

   LNP共递送Spike mRNA与优化tRNA(T7配方)的疫苗在小鼠模型中诱导的IgG滴度提升1.51倍，中和抗体NT50提高2.52倍。ELISpot检测显示特异性IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-4分泌细胞显著增加，流式分析证实CD4⁺和CD8⁺记忆T细胞应答增强。

这项发表于《Nature Communications》的研究具有多重重要意义：首先，"tRNA-plus"策略为mRNA治疗产品的效力提升提供了全新路径，且不受mRNA序列设计的限制；其次，建立的多位点tRNA修饰方案为开发tRNA疗法提供了技术范式；最后，mRNA-tRNA共递送系统展现了良好的转化应用前景。值得注意的是，研究也发现过度提升翻译速度可能影响蛋白质正确折叠，提示未来需综合考虑密码子分布、tRNA池组成和分子伴侣等因素。该技术的潜在应用场景包括circRNA/saRNA疫苗、体内CAR-T疗法和干细胞命运调控等广泛领域。正如作者Qing Xia团队强调的，这项研究不仅解决了mRNA疫苗的关键瓶颈问题，更为基于翻译调控的多种生物医学应用开辟了新思路。