基于纳米孔测序技术的高通量废水监测方法追踪SARS-CoV-2变异株动态分布

本研究针对COVID-19大流行期间变异株监测需求，开发了一种基于纳米孔测序（Nanopore sequencing）的废水监测方法。研究人员通过扩增SARS-CoV-2刺突蛋白（spike gene）1049 bp区域，结合三阶段PCR建库技术，成功实现对10,528份废水样本中变异株（VOC/VOI）比例的定量分析。该方法突破临床测序样本限制，为公共卫生决策提供实时变异株传播数据，尤其适用于监测能力有限的地区。

　　

随着COVID-19疫情持续蔓延，SARS-CoV-2病毒不断进化产生新的变异株（Variants of Concern, VOC和Variants of Interest, VOI），这些变异株可能具有更强的传播力或免疫逃逸能力。传统临床样本测序存在采样偏差和覆盖不足等问题，而基于废水的流行病学监测（Wastewater-Based Surveillance, WBS）能客观反映社区感染情况。然而，废水样本中病毒RNA易降解且存在抑制剂，如何建立高效、准确的变异株监测方法成为研究难点。

丹麦Statens Serum Institut的Lasse Dam Rasmussen团队在《Heliyon》发表研究，开发了一种基于牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technology）的高通量测序方案。研究人员选择刺突蛋白基因的1049 bp关键区域（nt 22799-23847），通过优化三阶段PCR扩增流程（初始RT-PCR→尾端添加PCR→条形码PCR），克服了废水样本中抑制剂干扰和RNA片段化问题。利用最小读长900 nt的严格过滤标准，将测序错误率控制在0.5%以下，实现对Alpha、Delta、Omicron等变异株的精准鉴别。

关键技术方法

研究团队收集丹麦全国230个采样点的24小时混合废水样本，通过PEG沉淀法浓缩病毒后提取RNA。采用RdRp基因RT-qPCR初筛阳性样本（Ct值26-39），每周选取病毒载量最高样本进行刺突基因扩增。通过特异性引物（nCoV-2019_76_F/nCoV-2019_78_R）进行三阶段PCR建库，使用MinION流动槽（R9.4.1）进行24小时测序。生物信息学分析采用Cutadapt质量过滤和minimap2比对，参考序列库随ECDC公布的VOC/VOI清单动态更新。

主要研究结果

1. 方法优化与性能验证

通过五倍稀释RNA样本显著提高扩增效率，900-1200 nt长度筛选将错误映射率从2-3%降至0.5%。在Ct值26-39范围内，测序成功率与病毒载量呈正相关（Ct26样本成功率71% vs Ct39仅5%），但部分RdRp阴性样本仍可成功测序，提示多靶点检测的必要性。

2. 大规模监测数据

15个月内完成10,528份样本分析，其中53%通过初始PCR，82%达到>1000条有效读长的质量标准。通过标准化处理（病毒载量/人口当量）实现跨采样点数据整合，准确捕捉到Delta向Omicron BA.2再向BA.5的变异株更替动态。

3. 变异株动态特征

测序数据揭示Omicron亚型共循环现象，包括BA.2与BA.5过渡期四变异株并存。研究发现废水检测到的变异株消退比临床报告延迟，可能与肠道病毒排出周期较长有关（文献报道最长持续49天）。

结论与意义

该研究建立的纳米孔测序方案具有三大优势：1）长读长（1049 bp）确保变异特征位点连锁分析；2）每个流动槽可同时处理50个样本，成本效益显著；3）动态参考序列库适应快速进化的变异株监测需求。作为临床监测的补充，该方法在丹麦全国85%人口覆盖的监测网络中验证了其可靠性，为资源有限地区提供了变异株追踪新策略。研究同时指出，未来需关注重组毒株带来的检测挑战，可能需要增加非刺突基因区域的扩增靶点。