线粒体碱基编辑器优化显著提升小鼠模型靶向编辑效率及其在疾病研究中的应用

本研究针对线粒体DNA(mtDNA)碱基编辑器编辑效率不稳定的问题，通过改造Hifi-sTALED和anHifi-sTALED两种新型编辑器，实现了mt-Rnr1等靶点编辑效率最高提升5.4倍，并成功构建线粒体功能障碍小鼠模型。该突破为线粒体疾病机制研究和治疗开发提供了高效工具，相关成果发表于《Molecular Therapy Nucleic Acids》。

　　

线粒体作为细胞的能量工厂，其基因组(mtDNA)突变可导致从肌肉萎缩到神经退行性病变等200多种疾病。然而，由于线粒体特殊的双层膜结构和缺乏高效修复机制，针对mtDNA的基因编辑一直面临巨大挑战。传统CRISPR系统无法作用于mtDNA，而早期开发的线粒体碱基编辑器如TALED（TALE-linked deaminase）虽能实现A-to-G转换，但在关键功能区域如mt-Rnr1（编码12S核糖体RNA）的编辑效率不足30%，严重制约了疾病模型的构建。

为突破这一瓶颈，Seongho Hong和Hyunji Lee团队从工程化改造入手，保留高保真变体TadA8e-V28R（可减少转录组脱靶效应）的核心结构，聚焦优化其他功能模块：一是引入DddA6-T1391A突变增强DNA解旋活性同时降低脱靶；二是改造TALE蛋白的αN端结构域提升DNA结合力。由此诞生的Hifi-sTALED和anHifi-sTALED，在保持单碱基编辑精度的基础上，将mt-Rnr1位点编辑效率从9.8%提升至62.87%，创造了目前哺乳动物线粒体编辑的最高纪录。

关键技术包括：1）小鼠受精卵mRNA显微注射构建突变模型；2）靶向深度测序分析编辑效率；3）线粒体应激测试（Seahorse XF HS系统）检测OCR和ECAR；4）Western blotting定量呼吸链蛋白表达；5）全mtDNA测序评估脱靶效应。

Alterations in sTALED enhance editing efficiency

通过对比V28R-sTALED、Hifi-sTALED和anHifi-sTALED在mt-Rnr1、mt-tRNA^K和mt-ATP6三个靶点的编辑表现，发现anHifi-sTALED在低效率位点实现5.4倍提升，且编辑窗口内碱基偏好性不变。

Improved editing efficiency through V28R-based modifications does not alter the editing pattern

在mt-ND4位点的A₂位置，anHifi-sTALED将编辑效率从3.7%提升至25.3%，证实其对位置特异性编辑的增强作用。

DddA6-T1391A and TadA8e-V28R variants mediate relatively precise targeting

相比DddA6-Q1310A/V106W组合，Hifi-sTALED单碱基编辑比例从3.62%提升至22.33%，且完全消除反向链编辑，证明其更高精度。

Assessing mutant mouse generation with Hifi- and anHifi-sTALED

成功获得异质性达96.26%的mt-Rnr1突变NIH3T3细胞系，全mtDNA测序显示无显著脱靶效应。

Phenotypic analysis of mt-Rnr1 mutation

突变细胞OCR值近乎消失，ATP下降40%；小鼠肌肉组织ATP水平与异质性程度呈负相关，但呼吸链蛋白表达未呈现线性变化，提示存在翻译补偿机制。

这项研究标志着线粒体基因组编辑进入高精度、高效率的新阶段。anHifi-sTALED突破性地解决了功能保守区编辑难题，为模拟m.1555A>G（人类耳聋相关突变）等致病变异提供了可靠工具。值得注意的是，虽然高异质性导致能量代谢障碍，但呼吸链蛋白表达的复杂变化暗示线粒体存在多层级调控网络，这为后续研究指明了新方向。该技术有望加速线粒体替代疗法评估和靶向药物开发，对攻克母系遗传疾病具有重大价值。