基于重组酶聚合酶扩增-侧向层析技术(RPA-LFA)的柑橘黄龙病菌粗提液快速检测方法开发

本研究开发了一种基于外膜蛋白(OMP)基因的重组酶聚合酶扩增-侧向层析检测技术(RPA-LFA)，可在37℃恒温25分钟内完成柑橘黄龙病(HLB)病原体——亚洲韧皮部杆菌(CLas)的检测。该技术对DNA模板的检测限达1 pg，粗提液检测限为10-4稀释度，具有操作简便、快速灵敏等特点，为柑橘苗木检疫和田间监测提供了新型诊断工具。

　　

Highlight部分专业翻译：

研究亮点

• 首次基于OMP基因开发CLas特异性RPA-LFA检测体系

• 实现DNA和粗提液双模板的同步优化检测

• 37℃恒温25分钟即可完成检测

• 检测灵敏度达1 pg DNA和10^-4稀释粗提液

• 田间适用性强，可用于柑橘种苗检疫

材料与方法

植物材料与样本处理

从印度多个柑橘园采集疑似HLB病叶作为阳性样本，温室健康植株作为阴性对照。样本经液氮研磨后，分别采用CTAB法提取DNA和磷酸缓冲液制备粗提液。

引物特异性验证

通过常规PCR验证RPA引物特异性，使用靶向rplA-rplJ基因的A2/J5引物确认CLas感染状态。结果显示除8、13、15号样本外，其余疑似样本均扩增出703 bp目标条带。

讨论

HLB对印度柑橘产业构成严重威胁，现有检测方法存在操作复杂、设备依赖性强等局限。本研究开发的HLB-RPA-LFA技术具有三大优势：(1)摆脱热循环仪依赖，实现恒温检测；(2)耐受粗提液中PCR抑制剂；(3)检测时间较常规PCR缩短80%。特别适合田间和检疫站点快速筛查。

作者贡献声明

Damini Diksha：实验设计、数据分析和论文撰写；Susheel Kumar Sharma：研究指导；Virendra K Baranwal：资源支持和概念设计；Baby Wangkhem：方法开发；Kavi Sidharthan：论文修订。

基金声明

本研究获DBT项目(BT/PR16723/NER/95/264/2015)和ICAR国家教授计划(Ag.Edn.F.No./27/01/NP/2022-HRD)资助。