NgAgo介导的基因组编辑技术在耻垢分枝杆菌中的应用及其在结核病研究中的意义

本研究首次证实NgAgo-F系统在耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）中实现高效基因组编辑，其优势包括：质粒构建简便（仅需200bp同源臂）、编辑效率达80%、操作周期缩短至8天。该系统为高GC含量分枝杆菌（如结核分枝杆菌）的功能基因组学研究提供了新工具，对结核病（TB）致病机制研究和新型抗结核策略开发具有重要价值。

　　

ABSTRACT

耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）作为非致病性快生长分枝杆菌模型，其基础代谢机制研究对加速结核分枝杆菌等病原体研究至关重要。尽管现有CRISPR-Cas12a等编辑工具可实现37%-75%的编辑效率，但存在sgRNA设计复杂、质粒转化困难等问题。本研究利用古细菌Argonaute蛋白（NgAgo）的截短变体NgAgo-F（717bp PIWI结构域），在耻垢分枝杆菌中建立了高效编辑平台。

INTRODUCTION

结核病（TB）已超越COVID-19成为全球头号传染病死因。耻垢分枝杆菌因其安全性和遗传可操作性，成为研究结核分枝杆菌致病机制的理想模型。传统编辑方法如等位基因交换效率仅10^-5-10^-6，而CRISPR-FnCpf1系统虽将周期缩短至7天，仍受限于大质粒构建难度。

RESULTS

Plasmid construction

研究者将hsp60启动子驱动的Flag-NgAgo-F插入温度敏感型穿梭质粒pKC1139，构建pKHNgAgo-F载体。该载体含apramycin抗性标记，可通过温度处理消除。

Solubility verification

在E. coli BL21(DE3)中表达的31.2kDa His-NgAgo-F蛋白经纯化验证可溶，Western blot进一步证实其在耻垢分枝杆菌上清液中的可溶性。

Gene knockout

针对氮代谢全局调控因子glnR（MSMEG_5784）和c-di-GMP受体ltmA（MSMEG_6479）：

1. 1.

   使用800bp同源臂时，glnR敲除株经PCR和qRT-PCR验证完全缺失转录本

2. 2.

   ltmA敲除株通过绿色荧光蛋白（sfGFP）报告基因筛选，测序确认基因置换

3. 3.

   同源臂长度测试显示：600bp可达80%效率，200bp仍保持20%效率

DISCUSSION

NgAgo-F系统优势显著：

• •

  无需PAM序列限制，适应高GC含量（67%）基因组

• •

  最小化质粒（200bp同源臂）提升难转化菌株的转染成功率

• •

  编辑周期较传统方法缩短3倍

该技术为阐明耻垢分枝杆菌代谢网络提供新工具，尤其适用于结核分枝杆菌毒力基因的功能解析。未来可通过优化RecA介导的同源重组途径，进一步提升多基因编辑效率。

MATERIALS AND METHODS

关键技术细节：

1. 1.

   电转化条件：3kV/4ms脉冲，30°C恢复3小时

2. 2.

   蛋白检测：抗Flag抗体（1:5000稀释）结合ECL显色

3. 3.

   qRT-PCR内参：持家基因sigA（MSMEG_2758）

本研究的创新性在于首次将NgAgo-F系统应用于放线菌门，其简易性、高效性为耐药结核菌株的基因治疗研究开辟了新途径。