腺相关病毒(AAV)上游工艺加速开发：从高通量系统到临床规模的突破性进展

这篇综述系统阐述了腺相关病毒(AAV)基因治疗载体从实验室规模到2000L商业化生产的全流程优化策略。研究团队通过高通量AMBR?15系统快速筛选最佳转染条件（DNA浓度1.08μg/106细胞），创新性地采用功率体积比(P/V)20W/m3的放大原则，结合单次使用混合器(SUM)和低剪切泵技术，在2个月内实现AAV9产量6.2×1010vg/mL的规模化生产，空壳率控制在22%，显著降低60%的单剂成本(COGs)。

　　

ABSTRACT

腺相关病毒(AAV)作为基因治疗的主要递送载体，面临生产成本高、工艺放大难等核心挑战。研究通过高通量AMBR?15系统建立质量源于设计(QbD)开发策略，重点优化转染参数（DNA用量0.25-1.5μg/10⁶细胞）与细胞密度（1-5×10⁶VC/mL）的相互作用，发现2.3×10⁶VC/mL结合0.25μg DNA的"低载高密"方案可实现60%成本降低，同时维持20%以上完整衣壳率。

1 Introduction

AAV制造瓶颈在于百万美元级单剂成本，主要源于质粒原料昂贵、空壳颗粒纯化损耗及漫长开发周期。研究创新点在于首次系统验证AMBR?15高通量平台与2000L生物反应器的工艺参数相关性，突破传统摇瓶模型与生产规模间的技术鸿沟。

2 Materials and Methods

采用HEK293F衍生细胞系在LV-MAX?培养基中培养，通过三质粒（Rep2Cap9:helper:GOI=0.6:0.2:0.2）转染生产AAV9。关键创新在于：

• •

  转染复合物制备：50L单次使用混合器(SUM)实现20L质粒溶液与FectoVir?-AAV试剂的均质化

• •

  放大控制：四叶轮泵以6.8L/min流速灌注，保持与AMBR?15相当的剪切力

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  分析技术：微滴数字PCR(ddPCR)定量载体基因组(vg)，ELISA检测衣壳(cp)

3 Results and Discussion

3.1 HEK293F三重转染优化

数据揭示"细胞密度效应"的临界值：超过5×10⁶VC/mL时细胞毒性显著增强。最佳条件(2.3×10⁶VC/mL+0.25μg DNA)实现7.9×10¹⁰vg/mL滴度，较传统工艺降低1.5μg DNA用量。

3.2 搅拌与通气桥接研究

发现通气量(0.004-0.02VVM)与功率体积比(8-160W/m3)的乘积与vg滴度显著相关(p<0.05)，确立20W/m3+0.004VVM的黄金参数组合。

3.3 AMBR?15至2000L加速放大

连续传代16代的种子细胞保持>90%活性，2000L规模获得6.2×10¹⁰vg/mL滴度，与AMBR?15结果偏差<20%。特别值得注意的是，摇瓶模型的46%完整衣壳率显著高于生物反应器系统，凸显规模依赖性质量差异。

4 Conclusion

该研究建立了一套完整的AAV生产加速路径：

1. 1.

   高通量筛选缩短开发周期至2个月

2. 2.

   SUM混合器+四叶轮泵解决转染复合物放大难题

3. 3.

   恒定P/V原则实现10万倍规模放大

   为基因治疗商业化生产提供了可复制的技术范本。