木薯A20/AN1基因(Metip4/8/11)的多重非生物胁迫功能解析及作物抗逆育种潜力研究

本文系统研究了木薯A20/AN1锌指蛋白家族基因Metip4、Metip8和Metip11在干旱、盐、温度胁迫及重金属（Mn/Cd/Cu）耐受中的调控机制。通过酵母双杂交、亚细胞定位、转基因拟南芥和病毒诱导基因沉默（VIGS）等技术，发现这些内含子缺失的核定位蛋白能通过调节脯氨酸含量、相对含水量、活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、内源脱落酸（ABA）和过氧化氢酶（CAT）活性等生理指标，共同调控多种胁迫响应。转录组分析揭示280个差异表达基因（DEG）和4条核心代谢通路（苯丙烷生物合成、淀粉蔗糖代谢、植物激素信号转导和核黄素代谢）的协同作用，为作物抗逆遗传改良提供了新靶点。

　　

ABSTRACT

气候环境变化对作物生产构成重大挑战。木薯(Manihot esculenta)作为重要的淀粉类块根作物，在粮食安全、能源生产和生物工业应用中具有重要地位，同时也是研究胁迫耐受的理想模型。A20/AN1结构域蛋白家族是植物非生物胁迫耐受的主调控因子，但大多数木薯A20/AN1基因(Metip)的功能尚未明确。本研究通过生物信息学预测、酵母双杂交、水稻原生质体亚细胞定位、拟南芥转基因和病毒诱导基因沉默(VIGS)等技术，对Metip4、Metip8和Metip11三个基因进行功能解析。

Graphical Abstract

木薯A20/AN1基因(Metip4、Metip8和Metip11)在多种非生物胁迫中发挥功能，在基因工程培育抗逆作物方面展现出潜力。

1 Introduction

A20/AN1锌指结构域蛋白家族又称胁迫相关蛋白(SAP)/锌指蛋白(ZFP)，其特征是N端含有A20结构域和/或C端含有AN1结构域。该家族基因在植物应对生物和非生物胁迫中起核心调控作用。木薯作为抗旱作物，其11个A20/AN1基因中，含内含子的Metip3/5/7已被证实具有多重胁迫耐受功能。本研究聚焦于三个无内含子基因Metip4/8/11，探究其功能共性与特性。

2 Materials and Methods

使用拟南芥(Columbia-0)、木薯品种华南08和水稻(粳稻9311)为材料。通过PCR、Southern blot和RT-qPCR验证转基因株系；利用pCAMBIA2300载体构建35S启动子驱动的融合GFP表达载体进行亚细胞定位；采用PEG介导法转化水稻原生质体；通过VIGS技术构建基因沉默木薯株系。生理指标检测包括NBT和DAB染色法测定O₂^·-和H₂O₂含量，以及CAT活性、MDA、脯氨酸和ABA含量测定。转录组测序在Novogene平台完成，差异基因定义为|log₂(FoldChange)|≥1.0且padj≤0.05。

3 Results

3.1 Metip基因特性

Metip4/8/11的CDS长度分别为483bp、513bp和540bp，均编码含单一A20和AN1结构域的蛋白。氨基酸序列比对显示三者同源性在53.61%-56.30%之间，A20/AN1结构域内存在氨基酸变异。亚细胞定位证实三者均为核定位蛋白，且无直接互作。

3.2 转基因拟南芥分析

T₂代转基因株系在PEG模拟干旱和NaCl胁迫下表现出增强的耐受性。32°C高温和10°C低温处理显示，所有转基因株系均能促进根系生长。重金属胁迫实验表明，Metip4/8株系对Cd耐受，而Metip11株系敏感；Cu胁迫下仅Metip4株系根系显著伸长。盆栽实验中，转基因植株在盐和干旱胁迫下生长更优，复水后存活率提高。生理检测显示干旱胁迫下转基因株系的ROS和MDA含量显著降低，脯氨酸含量和相对含水量升高。

3.3 基因沉默木薯分析

VIGS技术使Metip4/8/11表达分别降低71.22%、58%和65%。沉默株系对盐和干旱更敏感，叶片黄化枯萎严重。干旱胁迫下，沉默株系的O₂^·-、H₂O₂和MDA含量显著增加，CAT活性和脯氨酸、ABA含量下降。

3.4 转录组分析

Metip4/8/11沉默木薯分别鉴定到1140、1971和1287个DEG，其中280个为共有DEG。57.98%-76.06%的DEG呈下调趋势，包含热激蛋白(HSP)、脱水蛋白、MAPK等胁迫相关基因。

3.5 代谢通路分析

差异调控的KEGG通路(DRKP)显示：Metip4/8/11沉默株系共同影响苯丙烷生物合成、淀粉蔗糖代谢、植物激素信号转导和核黄素代谢4条通路。其中淀粉蔗糖代谢在Metip4沉默株系中上调，在Metip8/11中下调；植物激素信号转导在Metip4中上调而在Metip8/11中下调。

3.6 蛋白互作网络

预测蛋白互作(PPI)发现9个共同互作组合，涉及11个下调DEG编码的蛋白，包括热休克70kDa蛋白5、紫色酸性磷酸酶17/3、分子伴侣p23-1等关键应激蛋白。

4 Discussion

研究表明A20/AN1基因的功能特性不取决于内含子存在与否，而与其结构域组成密切相关。Metip4/8/11通过调节抗氧化系统、渗透保护物质和水分维持等共同机制增强胁迫耐受，但对Cd/Cu的响应存在差异。转录组和通路分析揭示了这些基因通过HSPs和RLKs感知胁迫信号，并调控E3泛素连接酶介导的蛋白降解途径。与Metip3/5/7相比，本研究基因在淀粉蔗糖代谢调控上表现出更显著的差异。

5 Conclusions

Metip4/8/11能正向调控植物多重胁迫耐受，其中Metip4在环境适应性育种中价值突出。这些核定位蛋白虽无直接互作，但通过共同影响生理生化指标、DEGs、蛋白互作网络和代谢通路实现功能趋同。研究为作物抗逆遗传改良提供了新靶点和理论依据。