PCR阻断引物开发助力海七鳃鳗DNA宏条形码饮食组成分析

这篇研究开发了8种PCR阻断引物（blocking primers），通过抑制海七鳃鳗（Petromyzon marinus）12S rRNA基因扩增，显著提升宿主鱼类DNA在宏条形码（DNA metabarcoding）饮食分析中的检出率。该技术突破传统方法限制，为血食性物种的分子饮食研究提供了高效工具。

　　

ABSTRACT

传统饮食评估方法对血食性物种如海七鳃鳗具有挑战性。DNA宏条形码技术为这一问题提供了解决方案，但通用引物在扩增过程中会同时捕获捕食者DNA。本研究设计了8种阻断引物，针对线粒体12S rRNA基因区域，成功抑制了99.9%的海七鳃鳗DNA扩增，显著提高了宿主鱼类序列的检出率。

Graphical Abstract

通过阻断引物技术，研究人员能够更清晰地检测消化系统样本中的宿主物种。这一方法为使用通用引物替代多种分类特异性引物提供了框架，极大提升了七鳃鳗饮食研究的效率。

1 Introduction

海七鳃鳗入侵北美五大湖后，对当地鱼类群落和渔业活动造成严重影响。传统损伤评估方法依赖伤口标记量化，存在局限性。分子饮食分析技术如DNA宏条形码，通过PCR扩增特定基因区域，可实现物种特异性饮食鉴定。然而，通用引物在扩增过程中会同时捕获捕食者DNA，降低数据利用率。

阻断引物通过两种机制抑制非目标DNA扩增：退火抑制和延伸阻滞。本研究采用退火抑制设计，针对海七鳃鳗与宿主鱼类间的23bp序列差异区域，开发了不同长度、末端修饰和纯化方法的阻断引物。

2 Methods

2.1 Blocking Primer Development

从NCBI数据库获取149种五大湖鱼类的12S rRNA基因序列，通过多序列比对确定海七鳃鳗特异性区域。设计了8种阻断引物，包含34bp和36bp两种长度，C3 spacer和inverted dT两种末端修饰，以及HPLC和脱盐两种纯化方法。

2.2 Primer Evaluation

2.2.1 Conventional PCR

琼脂糖凝胶电泳显示，所有含阻断引物的海七鳃鳗样本均无目标条带，而宿主鱼类样本均成功扩增。

2.2.2 Quantitative PCR

qPCR结果显示，阻断引物使海七鳃鳗DNA扩增抑制达13,494倍，而对宿主DNA扩增影响较小（抑制倍数1.5-10.3倍）。熔解曲线分析证实混合样本中宿主DNA扩增比例显著提高。

2.2.3 DNA Metabarcoding

测序分析表明，阻断引物使海七鳃鳗序列reads减少>99.9%，同时显著提高宿主序列reads。在野生样本CA14中，仅Blocker 2、3和6成功检测到宿主DNA。

3 Results

3.1 Gel Electrophoresis

所有阻断引物均有效抑制海七鳃鳗DNA扩增，且不影响宿主DNA检测。

3.2 Quantitative PCR

qPCR证实阻断引物对海七鳃鳗DNA的特异性抑制，熔解曲线显示混合样本中宿主DNA比例显著提高。

3.3 DNA Metabarcoding

测序数据显示，阻断引物使海七鳃鳗reads占比从96.76%降至极低水平，同时提高宿主reads检出率。

4 Discussion

4.1 Blocking Primer Effectiveness

所有阻断引物均表现出色，其中Blocker 2、3和6在最具挑战性的野生样本中仍保持高效。该技术克服了传统方法的局限性，为海七鳃鳗饮食研究提供了新工具。

4.2 Broader Applications

该技术不仅适用于五大湖入侵种群研究，还可用于海七鳃鳗原生地保护和其他寄生性七鳃鳗物种研究。

4.3 Implications and Future Directions

阻断引物技术使从洄游成体获取饮食信息成为可能，避免了传统方法的取样偏差。未来研究可进一步优化PCR条件，并探索环境因素对序列reads的影响。

这项研究为血食性物种的分子饮食分析提供了重要技术突破，对入侵物种管理和濒危物种保护都具有重要意义。