蟾毒灵通过调控PI15抑制TGF-β/Smad通路改善肺纤维化发展的机制研究

这篇研究首次揭示蟾毒灵(CB)通过靶向肽酶抑制剂15(PI15)调控TGF-β/Smad信号通路，在体内外模型中显著抑制肌成纤维细胞活化、上皮-间质转化(EMT)和胶原沉积，为肺纤维化(PF)治疗提供了新型候选药物。研究结合RNA-Seq、分子对接和Co-IP等技术，阐明了CB通过PI15-TGF-β1相互作用抑制Smad2/3磷酸化的分子机制。

　　

1 引言

肺纤维化(PF)作为致命的慢性进展性肺病，以异常成纤维细胞增殖和细胞外基质(ECM)过度沉积为特征。转化生长因子-β1(TGF-β1)驱动的肌成纤维细胞活化和EMT过程是PF发展的核心环节。目前临床用药尼达尼布和吡非尼酮仅能延缓病程，亟需开发新型治疗策略。

蟾毒灵(CB)是从中华大蟾蜍皮肤分泌物中分离的甾体化合物，既往研究证实其具有广谱抗肿瘤活性。值得注意的是，PF与肺癌存在共同的病理机制，包括EMT和TGF-β信号异常激活。肽酶抑制剂15(PI15)作为半胱氨酸丰富分泌蛋白家族成员，在ECM重塑中起关键作用，但其在PF中的功能尚未阐明。

2 材料与方法

研究采用ICR小鼠建立博来霉素(BLM)诱导的PF模型，设置预防性(第1-14天)和治疗性(第14-28天)给药方案，CB剂量为4 mg/kg腹腔注射。通过肺系数、羟脯氨酸(HYP)含量、Ashcroft评分等指标评估纤维化程度。体外实验选用MRC-5、HFL-1成纤维细胞和A549上皮细胞，采用CCK-8、划痕实验、免疫荧光等技术分析细胞行为。

高通量RNA测序鉴定差异表达基因(DEGs)，通过KEGG通路分析筛选关键信号通路。采用AlphaFold3和PyMOL进行PI15-TGF-β1分子对接，结合Co-IP验证蛋白互作。siRNA转染敲低PI15表达，Western blot检测α-SMA、Collagen I等纤维化标志物。

3 结果

3.1 CB对BLM诱导肺纤维化的预防作用

预防性CB给药显著改善BLM引起的体重下降(降低23.7%)，肺系数从6.8%降至5.2%。H&E染色显示CB组肺泡结构破坏减少67%，Masson染色显示胶原沉积降低54%。分子水平上，CB使α-SMA和Collagen I蛋白表达分别下调62%和58%，同时上调上皮标志物E-cadherin达2.3倍。

3.2 CB的治疗效果评估

治疗性给药方案中，CB使肺组织HYP含量从8.7 μg/mg降至5.2 μg/mg，血清IL-6水平降低41%。免疫组化显示α-SMA阳性区域减少63%，Western blot证实p-Smad2/3磷酸化水平显著抑制。

3.3 CB抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞活化

400 nM CB处理使TGF-β1刺激的MRC-5细胞迁移能力降低72%，α-SMA mRNA表达下调65%。划痕实验显示CB延迟伤口愈合率达58%，且无细胞毒性(CCK-8显示存活率>95%)。

3.4 CB逆转EMT进程

在A549细胞中，CB使TGF-β1诱导的E-cadherin表达恢复至对照组的85%，Vimentin蛋白水平降低61%。免疫荧光显示上皮标志物荧光强度增加2.1倍。

3.5 RNA-Seq分析与PI15的发现

测序鉴定出38个核心DEGs，其中PI15在BLM组表达上调4.8倍，CB处理后下调至1.9倍。KEGG分析显示TGF-β、PI3K-Akt和p53通路显著富集。

3.6 PI15的功能验证

siPI15转染效率达80%时，α-SMA和Collagen I表达分别降低59%和63%。分子对接显示PI15与TGF-β1结合能达-11.2 kcal/mol，Co-IP证实两者存在直接相互作用。

4 讨论

本研究首次阐明CB通过靶向PI15-TGF-β1轴抑制Smad2/3磷酸化的分子机制。PI15作为新型调控节点，其过表达可能促进TGF-β1信号通路的持续激活。值得注意的是，CB在10 nM-1 μM范围内呈现剂量依赖性抑制效应，且治疗窗较宽。

与现有抗纤维化药物相比，CB具有多靶点调控优势：既能抑制肌成纤维细胞转化，又能逆转EMT进程。研究局限性在于尚未解析CB-PI15的直接结合模式，未来需通过表面等离子共振(SPR)等技术进一步验证。

5 结论

该研究证实CB通过PI15-TGF-β1-Smad信号轴发挥抗肺纤维化作用，为临床转化提供实验依据。研究创新性在于发现PI15作为PF治疗的新靶点，并为天然药物活性成分的机制研究提供范式。