单细胞转录组解析坐骨神经横断损伤后的再生机制：揭示免疫-神经纤维母细胞-胶质细胞轴的关键调控网络

本研究针对周围神经损伤后功能恢复不全的临床难题，通过单细胞RNA测序技术系统解析了大鼠坐骨神经横断损伤后7个时间点的细胞动态变化。研究发现神经再生过程呈现三阶段特征：早期以巨噬细胞(Mac)和粒细胞(Gran)浸润为主；中期伴随增殖性间充质成纤维细胞(NF5)和修复型雪旺细胞(Gli0)的扩增；晚期则出现血管重塑和胶质细胞向成熟髓鞘化状态(Gli2/Gli5)的转变。研究首次揭示了TGF-β信号通路在神经再生中的时空特异性激活模式，并通过与挤压伤模型的比较发现了横断损伤特有的治疗时间窗。该成果为开发阶段特异性神经修复策略提供了重要理论依据。

　　

周围神经损伤一直是临床治疗的重大挑战，尤其是坐骨神经损伤患者中，仅有50%能达到有临床意义的恢复。传统治疗如神经移植和神经营养因子给药，受限于轴突再生不全和错误再支配等问题。这些局限源于对再生过程中雪旺细胞、成纤维细胞、免疫细胞和血管细胞时空协调机制的认知不足。既往研究多采用传统批量RNA测序技术，无法解析异质细胞群体的特异性响应。随着单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术的发展，科学家们得以在单细胞分辨率下探索神经修复的细胞图谱，但关于坐骨神经再生的时空调控机制仍存在重要知识缺口。

为系统解析周围神经再生机制，Yiben Ouyang等研究人员采用10x Genomics Chromium平台，对SD大鼠坐骨神经横断后0、1、3、5、7、10、14天共7个时间点的58,943个细胞进行scRNA-seq分析。通过Seurat软件进行无监督聚类，结合Monocle和slingshot拟时序分析，并利用CellChat解析细胞间通讯。同时采集近远端神经段进行bulk RNA-seq验证，并与挤压伤模型(GSE198582)进行对比分析。

主要技术方法

1. 1.

   建立SD大鼠坐骨神经横断模型，采集7个时间点的神经组织；

2. 2.

   10x Genomics单细胞转录组测序及Cell Ranger数据分析流程；

3. 3.

   Seurat(5.1.0)进行细胞聚类和差异基因分析；

4. 4.

   Monocle和slingshot拟时序分析胶质细胞和巨噬细胞分化轨迹；

5. 5.

   CellChat解析配体-受体互作网络；

6. 6.

   近远端神经段bulk RNA-seq及GSEA富集分析；

7. 7.

   免疫荧光检测TGF-β₁时空表达模式。

Temporal Cell Type Heterogeneity Following Sciatic Nerve Transection

UMAP分析揭示损伤后细胞组成动态变化：Day 1免疫细胞占比超95%(Mac和Gran为主)，Day 5神经纤维母细胞(NFs)重新出现，Day 7血管细胞倍增。免疫荧光显示S100b⁺雪旺细胞和NF200⁺轴突的空间分布变化，证实了单细胞数据的可靠性。

Clustering and Functional Profiling of Myeloid Immune Subtypes

髓系细胞展现显著异质性：Gran0-3亚群分别参与氧化还原平衡、Toll样受体信号等；Mac0-4亚群呈现从炎症清除(Mac0-1)向组织重塑(Mac3-4)的转变。拟时序分析发现Mo→Mac0→Mac2→Mac1/3和Mo→Mac0→Mac2→Mac4两条分化轨迹，后者高表达增殖基因CEP55和ASPM。

Dynamic shifts in NF subpopulations

NFs呈现阶段性更替：Day 0以NF2(内神经膜间充质细胞)为主；Day 1-3增殖型NF5(表达NCAPG和KIF20B)扩增；Day 5 NF0(SPON1⁺)和NF4(LRG1⁺/PLVAP⁺)主导基质重塑；Day 7-14 NF3(SCN3B⁺)参与TGF-β受体信号调控。

Glial Cell Subtype Differentiation and Signaling Activity

胶质细胞经历表型转换：Day 0髓鞘化雪旺细胞(Gli5，MPZ⁺/MBP⁺)→Day 3修复型(Gli0，CLCF1⁺)→Day 14再髓鞘化(Gli2，MAG⁺)。PTN信号在Gli-NF互作中持续激活，与人类神经纤维瘤数据保守。

TGF-β signaling exhibits sustained activation

bulk RNA-seq证实TGF-β通路在近端持续激活至Day 14，而远端呈短暂响应。免疫荧光显示TGF-β₁蛋白在近端长期滞留，与转录组数据互补。

讨论与意义

该研究首次绘制了坐骨神经横断损伤的时空单细胞图谱，揭示再生过程分为三阶段：(1)急性期(0-3天)巨噬细胞主导的炎症清除；(2)过渡期(3-7天)NF4介导的基质重塑；(3)慢性期(7-14天)雪旺细胞驱动的再髓鞘化。研究发现横断伤较挤压伤具有更强的早期免疫反应和延迟的胶质细胞恢复，提示临床干预需把握"黄金时间窗"。TGF-β信号通路的时空特异性激活模式，为开发阶段特异性治疗策略（如早期靶向Mac异质性、中期调控NF4活化、晚期促进髓鞘再生）提供了分子基础。该成果发表于《Journal of Neuroinflammation》，为周围神经再生研究树立了新范式。