简化PCR-核酸侧流免疫层析技术(PCR-NALFIA)的开发及其在枫树煤污病病原体Cryptostroma corticale现场检测中的应用

这篇研究开发了一种便携式PCR-核酸侧流免疫层析技术(PCR-NALFIA)，用于枫树煤污病(SBD)病原体Cryptostroma corticale的现场检测。该方法结合5分钟粗提DNA、便携式PCR仪和侧流层析试纸条，可在90分钟内完成检测，灵敏度达10个孢子或0.1mg菌体组织，特异性100%，冻干试剂室温稳定60天，为城市和天然枫树林的病害管理提供了快速可靠的诊断工具。

　　

【引言】

随着气候变化加剧，由真菌Cryptostroma corticale引起的枫树煤污病(SBD)在欧洲和北美西北部地区暴发流行，严重威胁城市绿化和原生枫树林。该病原体在干旱高温条件下由内生菌转为致病菌，导致树木枯萎死亡。传统检测方法依赖实验室PCR和形态鉴定，无法满足现场快速诊断需求。

【材料与方法】

研究团队收集了87份北美和欧洲样本，包括59份C. corticale阳性样本和28份阴性对照。基于ITS1区域设计特异性引物和生物素标记探针，建立三步检测体系：

1. 1.

   纤维素试纸5分钟粗提DNA

2. 2.

   便携式PCR仪进行35循环扩增

3. 3.

   金标免疫层析试纸条可视化检测

【结果】

检测体系表现优异：

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  灵敏度：可检测1.6pg基因组DNA、10个孢子或0.1mg菌体组织

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  特异性：100%准确区分C. corticale与相近的Biscogniauxia属真菌

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  稳定性：冻干试剂室温保存60天不影响检测效果

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  成本：单次检测约8.75加元，与常规qPCR相当

添加5%聚乙二醇8000(PEG)显著提高了腐朽木材样本的DNA提取效率，使12份菌体样本全部实现一次性检测成功。

【讨论】

该研究创新性地将ITS1靶标序列的高保守性与侧流免疫层析的便捷性相结合，解决了现有qPCR方法对Biscogniauxia属真菌36%假阳性的问题。特别设计的内部探针通过生物素-链霉亲和素系统与6-FAM标记引物协同作用，有效避免了引物二聚体导致的假阳性。

【应用前景】

这项技术为林业工作者提供了首个针对C. corticale的现场分子诊断方案，其优势体现在：

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  操作简单：无需专业培训，类似COVID-19快速检测

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  快速响应：2小时内完成采样到结果判读

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  安全评估：指导作业人员采取适当防护措施

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  处置决策：避免含过敏原孢子的病木不当处理

研究团队还制作了操作演示视频，直观展示该技术在野外环境中的应用流程，为其他森林病原体的现场检测技术开发提供了可借鉴的范式。