链霉菌来源的β-1,2-葡聚糖关联糖苷水解酶家族1β-葡萄糖苷酶的发现与功能机制解析

这篇研究首次报道了来自灰色链霉菌（Streptomyces griseus）的GH1家族β-葡萄糖苷酶（SGR_2426）特异性水解β-1,2-葡聚糖（Sopn）的结构与功能机制。通过晶体结构解析（分辨率2.20?）和突变验证，揭示Trp291和Gln229在底物识别中的关键作用，填补了GH1家族缺乏β-1,2-葡聚糖水解酶的空白，为微生物糖代谢网络研究提供新视角。

　　

1 引言

碳水化合物作为生物体能量来源和结构组分，其复杂多样的结构对应着庞大的酶系统。糖苷水解酶（GH）家族是其中最具多样性的类别，目前已有194个GH家族被鉴定。β-1,2-葡聚糖作为一种特殊的多糖，在微生物与植物互作（如根瘤菌共生）和病原体免疫逃逸（如布鲁氏菌感染）中发挥重要作用，但长期以来缺乏GH1家族相关酶的研究报道。

灰色链霉菌基因组分析发现，其SGR_2426基因与ABC转运体基因簇相邻，该转运体与已知的β-1,2-葡聚糖寡糖（Sop_n）结合蛋白同源。前期研究曾误将其归类为纤维素降解酶，但缺乏定量数据支持。本研究通过系统分析，首次证实SGR_2426是GH1家族中特异性作用于β-1,2-糖苷键的β-葡萄糖苷酶（BGL）。

2 结果

2.1 酶学特性

重组表达的SGR_2426（SGR_2426r）最适pH为5.5-7.5，在30°C时活性最高，表现出冷适应性特征。对硝基苯酚-β-葡萄糖苷（pNP-β-Glc）的水解活性最高，其K_m值为1.0 mM，显著优于对β-半乳糖苷（pNP-β-Gal）的5.8 mM。

2.2 底物特异性

酶动力学分析显示，SGR_2426r对β-1,2-葡寡糖（Sop_2-5）具有高度特异性，其V_max/K_m值（2.0-2.2 U/mg/mM）显著高于β-1,3-葡二糖（Lam₂）的0.089 U/mg/mM，而对β-1,4/β-1,6-葡二糖（Cel₂/Gen₂）几乎无活性。

2.3 结构解析

晶体结构显示SGR_2426r具有典型的（β/α）₈-桶状结构，但在169-195位残基处存在独特α螺旋插入。与Sophorose（Sop₂）的复合物结构（2.20?）揭示：

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  亚位点-1的葡萄糖单元通过6个氢键固定

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  亚位点+1仅由Gln229形成单氢键，且葡萄糖环被Trp291和Met171疏水夹持

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  分子动力学模拟显示底物结合诱导5个柔性区域（残基182-188等）构象变化

2.4 突变验证

W291E突变使Sop₂水解活性降低5倍，证实该残基对底物识别至关重要；Q229N突变则显著改变底物偏好性，表明Gln229决定β-1,2-糖苷键特异性。

3 讨论

该研究突破性地将SGR_2426定义为GH1家族首个β-1,2-葡聚糖关联BGL。与GH3家族同功能酶（如Lin1840）相比，其通过独特的Met171-Trp291疏水口袋和单氢键（Gln229）实现特异性识别。基因簇分析表明，SGR_2426可能与相邻的GH193家族酶（SGR_2427）协同参与Sop_n代谢。

进化角度上，GH1家族广泛存在β-1,2-糖苷水解潜力的结构基础，但SGR_2426通过169-195位残基形成的空间限制，有效排除了β-1,4/β-1,6-葡寡糖的结合。该发现为理解微生物糖代谢适应性进化提供了新范式。

4 方法

研究采用重组表达、酶动力学分析（GOPOD法测葡萄糖）、X射线晶体学（Photon Factory BL-5A线站）和分子动力学模拟（GROMACS 2022.4，1.5μs时长）等多学科技术，突变体通过SLiCE法快速构建。所有实验均设三次生物学重复，数据用R语言进行非线性回归分析。