INFOGEST国际研究网络优化α-淀粉酶活性测定方案的多实验室验证及其在淀粉消化研究中的重要意义

为解决α-淀粉酶活性测定中存在的实验室间变异大、温度标准不统一等问题，INFOGEST国际研究网络通过13个实验室的协作，开发了基于37°C四时间点测量的优化方案。研究验证了该方案对唾液、猪胰腺α-淀粉酶等样品的重复性（CV<15%）和再现性（CVR 16-21%），并确立37°C与20°C测定值的3.3倍换算关系，为消化研究提供了标准化工具。

　　

淀粉作为人类50%能量的主要来源，其消化过程高度依赖α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）的催化作用。然而长期以来，基于Bernfeld法的α-淀粉酶活性测定存在两大痛点：一是20°C单时间点测量的原始方案实验室间变异高达87%，二是生理相关温度（37°C）数据的缺失使得体外消化研究难以准确模拟人体环境。这种标准化的缺失严重阻碍了不同研究间数据的可比性，特别是在评估糖尿病生物标志物、术后并发症监测等临床应用场景时。

为破解这一困局，来自12个国家13个实验室的INFOGEST工作组开展了一项开创性的多中心验证研究。研究人员选取人类唾液（10名健康成人混合样本）和三种猪源酶制剂（两种胰腺α-淀粉酶及胰酶），通过优化底物处理（80%乙醇润湿马铃薯淀粉）、延长孵育时间（12分钟四时间点采样）和严格标准化溶液制备流程（冰浴搅拌20分钟），建立了全新的测定方案。关键技术包括：分光光度法检测还原糖（DNSA显色）、国际单位（IU）与Bernfeld单位的换算（1单位=0.97 IU）、以及温度比较实验设计（5个实验室平行测定20°C与37°C活性）。

Protocol implementation at each laboratory

所有实验室均成功采用不同设备（水浴/振荡培养箱）完成方案实施，验证了方法的普适性。微孔板与比色皿的校准曲线线性优异（r²=1.00），且两种检测形式的再现性差异不显著（CV_R 23% vs 27%）。

Assay performance

关键发现显示：

1. 1.

   四种测试产品在37°C的活性差异显著（p<0.0001），人唾液（877.4±142.7 U/mL）显著高于猪胰酶（206.5±33.8 U/mg）

2. 2.

   实验室内变异（CV_r）控制在8.9-12.5%，实验室间变异（CV_R）降至15.1-21.3%，较原始方法提升4倍

3. 3.

   淀粉水解动力学证实线性反应（r²>0.99），12分钟内水解度<35%确保底物充足

Comparisons between the incubations at 20 and 37°C

温度比较实验揭示37°C测定值系统性高于20°C（3.3±0.3倍），该换算因子为衔接历史数据（如INFOGEST建议的200 U/mL肠相目标活性）提供关键桥梁。值得注意的是，唾液样本在37°C的重复性略降（CV_r 12.5% vs 9.7%），反映生物流体的基质复杂性。

这项研究通过国际协作确立了α-淀粉酶测定的"金标准"，其意义体现在三个维度：

1. 1.

   方法学层面：四时间点设计和温度标准化解决了历史方案的精密度缺陷，Z-score分析显示>90%结果位于满意区间（|z|≤2）

2. 2.

   生理相关性：37°C测定更贴近人体环境，特别为应激 biomarker（唾液淀粉酶）和胰腺功能评估提供可靠工具

3. 3.

   应用指导：揭示当前INFOGEST推荐活性（基于20°C）与实际胰酶活性的潜在差异（6:1 vs 建议2:1的淀粉酶/胰蛋白酶比例），提示未来协议修订方向

正如讨论部分指出，该方案的成功验证仅是标准化进程的第一步。后续需扩大样本验证（如不同人群唾液）、探索温度转换因子在其它底物中的普适性，并开展体内外活性相关性研究。这些工作将进一步完善消化模型，为营养干预和疾病诊断提供更精准的评估工具。