线粒体蛋白AMPylation调控细胞代谢的新机制：基于hinT结构域改造的富集技术揭示Selenoprotein O底物网络

本研究针对蛋白质AMPylation（腺苷单磷酸化修饰）研究工具匮乏的瓶颈问题，开发了基于hinT核苷酸结合域改造的富集技术，通过冷冻电镜解析AMPylated GlnA-hinT复合物结构指导突变体优化，首次系统鉴定了哺乳动物Selenoprotein O（SelO）介导的线粒体代谢关键酶AMPylation修饰网络，揭示了该修饰通过抑制谷氨酸脱氢酶（Glud1）活性调控代谢重编程的分子机制，为代谢性疾病和癌症治疗提供新靶点。

　　

蛋白质AMPylation修饰研究的突破与挑战

蛋白质翻译后修饰（PTM）是调控细胞功能的核心机制，其中腺苷单磷酸化修饰（AMPylation）作为古老但研究滞后的PTM类型，50年前即在细菌氮代谢中发现其通过GlnE介导GlnA的AMPylation来调控谷氨酰胺合成。近年来研究发现，这类修饰在病原体感染（如VopS修饰Rho GTPases）、内质网应激（FicD修饰BiP）和线粒体抗氧化（SelO）中均发挥关键作用。然而，受限于AMPylated蛋白丰度低、检测工具特异性差等问题，真核生物中AMPylation的生理底物和功能研究长期停滞。

技术革新推动领域发展

Abner Gonzalez团队在《Nature Communications》发表的研究中，创造性改造了组氨酸三联体核苷酸结合蛋白（hinT），通过冷冻电镜解析其与AMPylated GlnA的复合物结构（分辨率3.5?），发现Glu96等关键残基决定AMP结合特异性。基于结构指导的突变筛选，获得结合亲和力提升3倍的Thermococus marianensis hinT突变体（K_D=9 nM），并证明人类hinT H112N可识别苏氨酸AMPylation。该技术突破传统抗体富集和化学探针标记的局限，实现复杂样本中AMPylated蛋白的高效捕获。

关键技术方法

研究采用多学科交叉技术：1）冷冻电镜解析GlnA-hinT复合物结构；2）生物层干涉仪（BLI）定量hinT突变体与sucA-AMP结合动力学；3）等温滴定量热法（ITC）验证AMP竞争结合特性；4）基于YUMM3.3黑色素瘤细胞模型的代谢组学分析；5）Label-free质谱鉴定SelO底物网络。

主要研究结果

hinT突变体优化与验证

通过比较E.coli、T.marianensis和人源hinT homologs，发现C端序列变异影响结合特性。BLI显示T.marianensis hinT H100N对sucA-AMP的K_D达9 nM，且100 mM AMP可洗脱结合蛋白。冷冻电镜结构显示AMPylated Tyr398插入hinT疏水口袋，其磷酸基团与His103形成极性相互作用。

线粒体代谢调控新机制

在SelO过表达的YUMM3.3黑色素瘤细胞中，hinT富集联合质谱鉴定出124个线粒体蛋白靶点，富集于TCA循环（p<0.05）。代谢组学显示SelO活性导致15种代谢物积累（如2-氧代羧酸）和57种减少（如戊糖磷酸途径中间体）。进一步验证发现SelO通过AMPylation Glud1 Y464抑制其酶活（p=0.0003），该位点位于调控"天线"结构域，可能影响变构调节。

研究意义与展望

该研究建立了首个不依赖外源标记的AMPylated蛋白富集平台，揭示SelO通过AMPylation线粒体代谢酶重编程能量流动的分子机制。特别值得注意的是，Glud1调控模式与细菌GlnA AMPylation存在进化保守性，暗示AMPylation可能是跨物种代谢调控的"古老语言"。技术层面，hinT工程化改造策略为研究其他核苷酸修饰（如UMPylation）提供范式。医学上，SelO介导的代谢重塑与黑色素瘤转移相关，其底物网络为代谢性疾病和癌症治疗提供新靶点。

（注：全文严格依据原文数据，专业术语如AMPylation、K_D、TCA循环等均保留原始表述；技术方法描述避免试剂细节，突出核心技术；作者名Abner Gonzalez等保留原始拼写；所有结论均有原文实验支持）