多靶向mRNA-CAR T细胞疗法在胶质母细胞瘤切除模型中的临床前疗效突破

本研究针对胶质母细胞瘤(GBM)治疗中传统病毒载体CAR T细胞疗法的局限性，创新性地结合mRNA-CAR T细胞瞬时表达特性、多靶向策略（HER2/IL13Rα2/EphA2）及最大程度肿瘤切除术(NTR)，在异种移植模型中实现完全缓解(CR)。通过电穿孔(EP)和脂质纳米颗粒(LNP)双递送技术，证实5天扩增的MVCAR T细胞在切除后局部注射可形成7天治疗窗口，显著优于单靶向CARPool方案，为实体瘤免疫治疗提供可转化平台。

　　

胶质母细胞瘤(GBM)作为最具侵袭性的原发性脑肿瘤，标准治疗包括最大范围手术切除联合放化疗，但患者预后仍极差。尽管嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法在血液肿瘤中取得突破，其对抗实体瘤却面临多重障碍：肿瘤微环境(TME)的免疫抑制、靶抗原异质性表达、CAR T细胞浸润不足以及持久性差。尤其对于GBM，传统病毒载体CAR T存在插入突变风险、制造复杂等问题，而mRNA-CAR T凭借瞬时表达特性虽安全性更优，但受限于表达持续时间难以对抗大体积肿瘤。

为突破这些限制，Oula K. Dagher等团队在《Molecular Therapy Nucleic Acids》发表研究，开创性地提出三管齐下策略：采用非病毒载体（电穿孔EP和脂质纳米颗粒LNP）递送多靶向mRNA-CAR，结合最大程度肿瘤切除手术(NTR)，在临床前模型中系统评估疗效。研究通过构建U87-MG系列基因编辑细胞系(U87_HER2^null、U87_HER2⁺_EphA2^KO等)，建立异种移植切除模型，并首次揭示mRNA-CAR T细胞在GBM治疗中的动态作用机制。

关键技术包括：1) CRISPR-Cas9构建抗原敲除GBM细胞系；2) 电穿孔与LNP双递送系统比较；3) 实时阻抗分析(xCELLigence)与流式细胞术量化杀伤效率；4) 近全切除(NTR)与次全切除(STR)手术模型；5) 患者来源胶质瘤干细胞(GSC)验证。

多靶向mRNA-CAR T细胞组合的筛选

通过设计28种双/三靶向组合（CARPool混合单靶向细胞 vs MVCAR单细胞多靶向），发现针对HER2/IL13Rα2/EphA2的MVCAR#2（含4H5 scFv）对U87-HER2⁺细胞杀伤率达90%，且能清除抗原缺失的U87KO_pool细胞，证实旁观者杀伤效应。

扩增条件对疗效的影响

5天扩增的MVCAR#2在低效靶比(2.4:1)下仍保持高效杀伤，分泌IL-2/IFN-γ水平显著高于静息态T细胞（p<0.01），而后者仅在NTR模型中通过T细胞固有杀伤机制起效，但伴随移植物抗宿主病(GvHD)风险。

切除范围与治疗窗口

NTR手术保留5%残余病灶时，局部注射MVCAR#2可形成7天关键治疗窗口（术后2-8天），实现87.5%完全缓解(CR)，且无GvHD；而单次注射即延长原位移植模型生存期73.7%，显著优于CARPool方案（p<0.001）。

LNP递送系统的优化

MVCAR#2_LNP直径103nm、PDI<0.2，CAR表达持续72小时，在NTR模型中与EP递送疗效相当（CR率83.3% vs 87.5%），但rhChimera结合强度存在差异（p<0.05）。

患者来源GSC验证

在GSC_5077/8979中，MVCAR#2对IL13Rα2^high/EphA2^high细胞杀伤率提升2倍，证实临床转化潜力。

该研究首次阐明mRNA-CAR T细胞在GBM切除后的动态疗效机制：早期依赖CAR特异性杀伤，后期转为T细胞固有清除。多靶向策略通过种群多样性（如图S7所示）克服抗原逃逸，而LNP技术为自动化生产提供可能。值得注意的是，静息态T细胞在NTR后的强效杀伤提示其作为即时疗法的潜力，但需权衡GvHD风险。这些发现为GBM术后联合免疫治疗奠定基础，并为实体瘤中mRNA-CAR的剂量设计提供范式。