综述：双极电子顺磁共振光谱定量蛋白质构象系综的最新进展

本篇综述系统梳理了双极电子顺磁共振（EPR）与双电子-电子共振（DEER）技术在蛋白质动态构象研究中的突破性应用。作者重点展示了该技术在纳米级距离分布测量、多态蛋白质能量景观解析方面的独特优势，并探讨了自旋标记创新、细胞内测量、氘代技术及多方法整合等前沿进展，为生物大分子机制研究提供了全新视角。

　　

引言

脉冲双极电子顺磁共振（EPR）技术已成为解析生物大分子动态结构的利器。其中双电子-电子共振（DEER）能精确测量15–80 ?范围内的自旋标记距离分布，特别适用于研究无序蛋白、多构象体系及瞬时蛋白互作。该技术正与冷冻电镜、荧光共振能量转移（FRET）、核磁共振（NMR）等方法深度整合，结合AlphaFold等预测工具，推动结构生物学进入动态研究新时代。

最新应用案例

在氨基酸转运蛋白GadC研究中，DEER成功捕获质子驱动下内向/外向构象转换的分子机制。针对ABC转运蛋白家族，研究者将DEER与冷冻电镜数据耦合，首次阐明其底物输出与ATP水解的构象偶联过程。膜蛋白Pgp的多构象分析则揭示了化疗药物外排的变构调控网络。

自旋标记技术革新

传统半胱氨酸连接的氮氧自由基（R1）标记存在侧链过长、易还原等缺陷。新型标记策略包括：

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  马来酰亚胺衍生化保护技术，显著提升氮氧自由基在细胞裂解液中的稳定性

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  基于吡咯啉的刚性标记体，使距离分布标准差降至0.5 ?

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  镧系金属标记（如Gd(III)-DOTA）将测量范围扩展至100 ?

细胞内测量突破

实现原位标记仍面临挑战。当前方案包括：

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  铜(II)-NTA复合物靶向基因编码的dHis基序

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  生物正交标记技术实现活细胞特异性标记

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  电穿孔辅助递送Gd(III)标记物

氘代技术进展

全氘代蛋白可将自旋相位记忆时间（T_m）延长3-5倍，使最大检测距离突破至160 ?。选择性甲基质子化策略则能解析多峰距离分布，在膜蛋白研究中展现独特价值。

多技术联用策略

与FRET形成完美互补：

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  EPR提供绝对距离标定（无需FRET的参照校准）

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  FRET优势在于单分子灵敏度

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  联合分析揭示核糖体解码中心动态可达亚埃级精度

¹⁹F电子-核双共振（ENDOR）则填补了15 ?以下短程测量的空白，通过引入氟代氨基酸（如对三氟甲基苯丙氨酸）实现高精度短距探测。

数据分析新范式

神经网络算法正革新距离分布解析：

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  基于模拟数据的深度学习模型提升噪声数据鲁棒性

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  全局拟合策略整合不同生化条件数据

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  马尔可夫状态模型实现构象动态路径可视化

未来展望

该领域将向更高时空分辨率、更复杂生理环境研究迈进。自旋标记化学的持续创新，结合冷冻电镜断层扫描、微流控芯片等新技术，有望在膜蛋白变构调控、相分离体系等前沿领域取得突破。