综述：冷冻聚焦离子束铣削技术在冷冻电子断层扫描中的应用：塑造原位结构生物学的未来

这篇综述系统阐述了冷冻聚焦离子束(cryo-FIB)技术如何通过制备细胞薄片推动冷冻电子断层扫描(cryo-ET)发展，成为原位结构生物学研究的关键工具。作者探讨了离子束损伤表征、等离子体离子源(PFIB)应用、自动化工作流优化等前沿进展，并展望了多细胞体系研究的技术挑战与发展方向。

　　

引言

冷冻聚焦离子束(cryo-FIB)铣削技术已成为冷冻电子显微镜(cryo-EM)领域革命性的样本制备方法。这项源自材料科学的技术，通过液态氮冷却台实现低温适配，能够制备保持天然状态的细胞薄片，为研究细胞内大分子复合物提供了前所未有的窗口。尽管在半导体行业已有数十年应用历史，但将其应用于冷冻含水生物样本仍面临独特挑战——从离子束诱导的表面损伤到绝缘样本的电荷积累问题。

没有样本就没有电子显微镜

离子束对生物样本的影响始终是核心研究课题。研究表明，30kV加速电压下，氩/氙离子会产生30-45nm损伤层，而镓离子损伤层达60nm。这一数据通过Z因子B因子分析和二维模板匹配(2DTM)等技术获得，但考虑到核糖体直径仅25nm，仍需更小分子标记物验证。等离子体离子源(PFIB)的引入带来转机：氙离子虽能提高铣削速率，但条纹效应明显；氩离子损伤与镓离子相当但穿透更深。材料科学中的多离子策略（如氙离子粗铣+氩离子精修）为生物样本制备提供了新思路。与此同时，自动化软件的发展使单个电镜网格上制备的薄片数量从<5片跃升至数十片，机器学习辅助定位技术正逐步消除最后的人工干预环节。

转向结构生物学家的梦想：分子分辨率下的完整生物体

提升可成像体积是当前研究热点。通过"华夫饼"式样本制备和体积提取技术，研究者能从40×40×20μm3样本中每1-5μm获取连续切片，使多细胞组织研究成为可能。同步发展的还有电子断层扫描数据采集策略：蒙太奇成像、多位置采集和方形照明技术将单次倾斜系列覆盖面积提升数个数量级。然而，离子束物理特性决定了真正的无损连续切片难以实现，因此相关技术发展至关重要。集成荧光显微镜(cryo-FLM)能精确定位目标结构，但薄片转移过程中的支撑膜变形问题，使得原位荧光观察成为更优选择。

原位结构生物学的剩余挑战

样本冷冻仍是首要瓶颈：高压冷冻(HPF)虽能处理更大样本但成功率波动大，而介于 plunge freezing 和 HPF 之间的喷射冷冻技术可稳定冷冻20μm厚样本。更严峻的是数据爆炸挑战——随着多位置采集技术的应用，单次电镜会话可产生数千组断层扫描数据。这要求开发基于深度学习的自动分割算法，并建立更完善的数据共享平台。正如冷冻电镜先驱Humberto Fernández-Morán所预见，当技术障碍被克服后，如何从海量数据中提取生物学意义将成为新的挑战。

结论

从离子束损伤控制到多细胞样本处理，cryo-FIB/cryo-ET技术正推动结构生物学进入新纪元。未来十年，随着等离子体离子源优化、光束整形技术和人工智能分析的进步，这项技术有望揭示更复杂的多细胞体系分子机制，最终实现从单分子到组织水平的全景式结构解析。