骨骼肌肌联蛋白去磷酸化诱导的结构重组及其在被动张力调控中的作用

本研究通过原子力显微镜(AFM)单分子成像技术，首次揭示骨骼肌肌联蛋白(titin)去磷酸化导致其C端区域发生显著构象变化，形成紧凑的卷曲结构。该发现为解释蛋白激酶通过磷酸化调控肌肉被动张力提供了直接结构证据，对理解心肌病理性僵硬机制具有重要意义。

　　

肌肉就像精密的生物弹簧，其弹性特性很大程度上依赖于一种名为肌联蛋白(titin)的巨型蛋白质。作为肌节第三 filament 系统，titin 横跨半个肌节，从Z盘延伸到M线，像分子弹簧一样在肌肉拉伸时产生被动张力。近年研究发现，蛋白激酶通过磷酸化修饰可双向调节被动张力，但磷酸化如何直接影响 titin 分子结构仍缺乏单分子水平的证据。更关键的是，在心肌病等病理状态下普遍观察到 titin 低磷酸化现象，这可能是导致心肌僵硬的潜在机制。

为解开这一谜题，来自匈牙利塞梅尔维斯大学的 Andrea Balogh-Molnár 团队在《International Journal of Biological Macromolecules》发表重要研究。他们从兔背最长肌分离天然 titin 分子，利用λ蛋白磷酸酶(λPP)诱导去磷酸化，通过原子力显微镜首次捕捉到 titin 单分子去磷酸化后的纳米级结构重组。

研究采用三项关键技术：1) 从兔骨骼肌通过尺寸排阻色谱分离天然 titin 片段；2) 使用λPP酶处理结合 ProQ Diamond/SYPRO Ruby 双染色定量去磷酸化效率；3) 原子力显微镜单分子成像分析构象变化。

2.1 骨骼肌肌联蛋白的分离

通过 CL-2B 凝胶过滤柱分离获得 T2（含 PEVK 结构域和 A-band 区域）和 T3（近端 Ig 段）两个主要片段。Western blot 证实 T2 含 C 端 M8M10 表位而 T3 仅含 N 端 T12 表位，AFM 显示 T2 寡聚体保持 M 带组装特征。

2.2 肌联蛋白的去磷酸化

λPP 处理使 ProQ/SYPRO 比值下降约50%，证明成功建立低磷酸化状态。

2.3 去磷酸化诱导的结构改变

AFM 揭示惊人变化：去磷酸化 T2 形成"头-尾"结构，C 端区域（约430 nm 链段）卷曲成高度增加2.6倍的球状头部，而尾部（231 nm）保持延伸。聚合物力学分析显示，头部区域持续长度从22 nm降至5 nm，表明磷酸基团通过静电排斥维持链伸展。T3 片段同样出现头部结构，但卷曲程度较轻。

3.1 骨骼肌肌联蛋白片段的去磷酸化

发现 titin 存在λPP抗性区域，可能与其独特的 I-band 结构特征相关。

3.2 肌节中肌联蛋白磷酸化依赖的结构稳定

磷酸化通过两种机制维持 titin 结构：1) A-band 区密集磷酸化稳定其与肌球蛋白 thick filament 的相互作用；2) N 端磷酸化防止链塌陷。

3.3 A-band 与 I-band 区磷酸化的功能差异

提出"二分调控"模型：I-band 磷酸化（如 PEVK 域 S11878/S12022）精细调节弹性，而 A-band 磷酸化主要维持结构刚性。

这项研究首次在单分子水平证明 titin 磷酸化状态直接决定其构象，特别是 A-band 区域的密集磷酸化对维持肌节结构至关重要。该发现为解释心肌病中 titin 低磷酸化导致被动张力异常提供了结构基础，同时揭示了激酶/磷酸酶平衡在肌肉机械适应性调控中的核心作用。研究建立的单分子分析范式为后续探索其他翻译后修饰对肌节蛋白的影响提供了方法论范例。