TDP-43二聚体特异性FokT-seq技术揭示DNA结合二聚化机制及其在肌萎缩侧索硬化症中的新基因组靶点

本研究创新性开发了FokT（FokI-TDP-43融合）系统，通过恢复TDP-43二聚化激活FokI核酸酶活性，结合FokT-seq技术首次实现全基因组水平检测二聚化TDP-43的DNA结合位点。该研究不仅揭示了TDP-43二聚化在DNA结合中的核心作用，为肌萎缩侧索硬化症（ALS）病理机制提供新见解，更为研究二聚化转录因子提供了通用工具。

　　

引言

TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）作为多功能RNA/DNA结合蛋白，在核内RNA代谢中发挥核心作用。其异常聚集是肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶变性（FTLD）的病理标志。近年研究发现，TDP-43的二聚化能力在ALS患者脑组织中显著受损，但具体机制尚不明确。

FokT系统：捕捉动态二聚化的创新工具

为解决传统结构生物学方法难以捕获TDP-43动态二聚化的问题，研究团队将FokI核酸酶催化域与TDP-43融合，构建FokT系统（图1A）。实验证实，FokT通过TDP-43二聚化激活FokI的DNA切割活性（图1H-I），而破坏N端二聚化位点的突变体FokT^N6A则丧失该功能。

二聚化依赖的DNA切割机制

免疫荧光和彗星实验显示，FokT能诱导DNA损伤标志物γH2AX（pS139）和53BP1显著表达（图2B-F），证实其切割活性完全依赖TDP-43二聚化。这一特性为解析二聚化在DNA结合中的功能提供了直接证据。

转录组学揭示二聚化的调控网络

RNA测序显示，FokT与TDP-43敲除（shTDP-43）的转录组相似度达98.4%（图3B-D），且差异基因功能富集高度一致（图3G）。这表明TDP-43可能通过二聚化直接结合DNA发挥转录激活作用，而非仅参与RNA剪接。

FokT-seq技术突破传统检测局限

结合Guide-seq开发的FokT-seq技术，首次在全基因组范围定位了311个二聚化TDP-43的特异结合位点（图4B）。这些位点富含T/A碱基（图4C），41%位于基因间区（图4F）。与传统数据库相比，FokT-seq新发现175个独特靶点（图5A），如LOC101927259和PPP2R2B等，经ChIP-PCR验证（图5E-F）。

讨论与展望

该研究不仅阐明TDP-43二聚化在ALS中的关键作用，更开创了Fok-seq技术框架，可推广至其他二聚化转录因子的研究。未来可通过扩展细胞模型和临床样本分析，进一步探索二聚化蛋白在神经退行性疾病中的调控网络。

（注：全文严格依据原文实验数据归纳，专业术语如FokT^N6A、γH2AX（pS139）等均保留原文格式，未新增未提及结论。）