综述：核磁共振技术在大型RNA研究中的应用

这篇综述系统总结了核磁共振（NMR）技术在大型RNA（>50核苷酸）结构解析中的突破性进展，重点介绍了2H/15N/13C同位素标记、分段标记（segmental labeling）和新型H2/H8检测方法如何克服传统1H-13C相关谱的弛豫限制，使700核苷酸（242 kDa）级RNA的原子级结构探测成为可能。

核磁共振技术解锁大型RNA结构之谜

三维结构解析（>50核苷酸）

当前PDB数据库中仅存46个超过50核苷酸的RNA溶液NMR结构，最大单链达155核苷酸（50.5 kDa）。传统方法受限于¹H-¹³C强偶极耦合导致的快速横向弛豫，而分段¹⁵N标记技术成功解析了HCV IRES中315核苷酸结构域II的构象。

RNA动态特性研究

通过实时NMR和弛豫分析，发现HIV-1 5′-leader的356核苷酸二聚体存在微秒级构象交换。甲基-TROSY技术虽在蛋白质研究中突破1 MDa壁垒，但对RNA芳香族¹H核效果有限。

大型RNA（>300核苷酸）结构探测

核苷酸特异性氘代技术使712核苷酸（230 kDa）HIV-1 RRE的局部结构解析成为可能。腺苷H2质子因其位于A型螺旋小沟而弛豫较慢，成为关键探测靶点。

分而治之策略

通过比较亚结构域与全长RNA的¹H-¹H NOESY指纹区，证实HIV-1 TAR等元件能保持天然构象。计算预测与NMR数据的结合大幅提升了效率。

亚氨基谱与氢键检测

参与Watson-Crick碱基对的鸟苷H1/尿苷H3质子（10-15 ppm）可反映二级结构。JNN-COSY等新技术能检测N-H···N氢键，但溶剂交换问题在>100 kDa系统中仍具挑战性。

同位素编辑技术

• ¹³C编辑：232核苷酸HIV-1 RRE中¹³C标记腺苷信号严重增宽，凸显偶极耦合问题

• ¹⁹F编辑：2-氟腺苷成功监测73核苷酸核糖开关构象变化

• ²H编辑：氘代使NOESY谱简化，弛豫速率降低6.5倍

创新检测方法

• 腺苷H2检测：利用其长弛豫时间特性，已应用于155核苷酸RNA

• ¹⁵N/²H编辑H2/H8谱：通过¹H-¹⁵N二键标量耦合（7-15 Hz）关联信号

• 残基偶极耦合（RDC）：测定HIV-1 TAR等螺旋间取向，精度达±5°

技术前沿展望

T7 RNA聚合酶体外转录结合PLOR（位点选择性标记）技术大幅降低NTP成本（$500-1000/样品）。未来需开发更经济的分段标记方案，并整合AI辅助化学位移归属工具，以推动非编码RNA的功能研究。